مقايسة الموت العصبي لتقييم موت الخلايا في نموذج الصرع خارج الجسم الحي

الملخص

المصدر: Carvalho، M.، et al.، نموذج لتكوين الصرع في ثقافات الشرائح العضوية لقشرة الأنف والحصين. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو تقنية تقييم الموت العصبي في شرائح النمط العضوي لقشرة الأنف والحصين. يحدث الموت العصبي عن طريق نوبات الصرع المتطورة - التي تشبه الصرع في الجسم الحي - ويتم اكتشافه من خلال التلوين المزدوج للخلايا الميتة باستخدام يوديد البروبيديوم والتألق المناعي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير شرائح قشرة الأنف والحصين

ملاحظة: يستخدم تحضير شرائح قشرة الأنف والحصين الفئران P6-7 Sprague-Dawley.

1. إعداد الثقافة والإعداد الوسيط
   1. في اليوم السابق للثقافة ، قم بإعداد الوسائط المطلوبة ووضعها عند 4 درجات مئوية.
   2. تحضير وسط التشريح: 25 ملي مولار جلوكوز في محلول الملح المتوازن من جي (GBSS).
   3. تحضير وسط الاستزراع: 50٪ Opti-MEM ، 25٪ HBSS ، 25٪ مصل الحصان (HS) ، 25 ملي جلوكوز ، 30 ميكروغرام / مل جنتامايسين.
   4. تحضير وسط الصيانة: Neurobasal-A (NBA) ، 2٪ B27 ، 1 ملي مولار L-glutamine ، 30 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، HS (15٪ ، 10٪ ، 5٪ و 0٪).
2. حصاد الدماغ
   1. قبل بدء المزرعة مباشرة ، أضف 1.1 مل من وسط الاستزراع إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار باستخدام ماصة P1000 وضعها عند 37 درجة مئوية.
   2. ضع جميع المعدات (مجهر التشريح ، مفرمة الأنسجة ، مصباح التشريح ، أدوات التشريح ، الأقطاب الكهربائية ، الألواح ، الإدخالات ، وأوراق الترشيح) داخل خزانة السلامة البيولوجية وتعقيمها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
   3. اضبط سمك الشريحة إلى 350 ميكرومتر.
   4. اسحب GBSS من الثلاجة. أضف 5 مل من GBSS إلى ستة أطباق بتري. ستكون هناك حاجة إلى ستة أطباق بتري لكل.
   5. القتل الرحيم جرو الفئران. قم بقطع الرأس باستخدام مقص حاد في قاعدة جذع دماغ.
   6. اغسل رأس ثلاث مرات في GBSS البارد وخذه داخل خزانة الأمان.
3. عزل الأنسجة وتحضير الشرائح
   1. أدخل ملقطا حادا بإحكام في تجويف العين لتثبيت الرأس.
   2. باستخدام مقص رفيع ، قم بقص الجلد / فروة الرأس على طول خط الوسط بدءا من الثقبة الفقرية باتجاه الفص الجبهي وضعه جانبا.
   3. قطع بنفس الطريقة الجمجمة وعلى طول الشق المستعرض الدماغي (المسافة بين الدماغ والمخيخ). باستخدام ملقط طويل منحني ، حركه بعيدا عن بعضه البعض.
   4. تخلص من المصابيح الشمية بملعقة. أخرج الدماغ من الرأس وضعه في GBSS شديد البرد مع توجيه السطح الظهري لأعلى (الشكل 1 أ).
   5. أدخل الملقط الدقيق في المخيخ واذهب على طول خط الوسط مع فتح الملعقة لكل نصف كرة بعناية فائقة (الشكل 1 ب).
   6. باستخدام ملقط منحنى قصير ، قم بإزالة الأنسجة الزائدة التي تغطي الحصين بعناية ، دون لمس بنية الحصين. ثم باستخدام ملعقة ، اقطع أسفل كل حصين (الشكل 1 ج).
   7. التقط نصف الكرة الأرضية وضعه ، مع توجيه الحصين لأعلى ، على ورق ترشيح. كرر الإجراء مع نصف الكرة الآخر وضعه بالتوازي مع النصف الأول ، في ورق الترشيح. ضع ورق الترشيح على مفرمة المناديل ، بحيث يكون نصفي الكرة الأرضية عموديا على الشفرة ، وقم بقص نصفي الكرة الأرضية إلى شرائح 350 ميكرومتر (الشكل 1 د).
   8. ضع الأنسجة المقطعة في طبق بتري مع GBSS البارد (الشكل 1E).
   9. افصل الشرائح بعناية باستخدام أقطاب الطرف المستديرة (الشكل 1F). احتفظ فقط بالشرائح ذات قشرة الأنف والحصين السليمة هيكليا. يجب تحديد مناطق DG و CA بشكل مثالي ، وكذلك القشرة المخية الداخلية وحول الأنف (الشكل 1G).
   10. ضع كل شريحة على الملحق (الشكل 1H-I) ، باستخدام ملعقة وقطب كهربائي دائري. قم بإزالة وسط التشريح الزائد حول كل شريحة باستخدام ماصة P20 (الشكل 1J). يمكن استزراع أربع شرائح من قشرة الأنف والحصين في ملحق واحد (الشكل 1 ك).
4. الحفاظ على الثقافة
   1. قم بتغيير الوسيط كل يومين.
   2. قم بتسخين الوسط عند 37 درجة مئوية.
   3. خذ الأطباق من الحاضنة. التقط كل ملحق عن طريق إمساك الحافة البلاستيكية بالملقط (الشكل 1L).
   4. استخدم يدا حرة لشفط الوسط من البئر. ضع الملحق مرة أخرى في البئر وأضف 1 مل ، مع ماصة P1000 ، من وسط دافئ طازج (الشكل 1M). كرر لجميع الإدخالات. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة بين الغشاء والوسط.
      ملاحظه: تخضع الشرائح الشبيهة بالصرع لحرمان تدريجي وخاضع للرقابة من المصل في الوسط. من 9 أيام في المختبر (DIV) فصاعدا ، يتم الاحتفاظ بالشرائح في الدوري الاميركي للمحترفين بدون HS.

2. مقايسة امتصاص PI

< p class = "jove_content" >ملاحظة: تم تقييم موت الخلايا من خلال مراقبة الامتصاص الخلوي للصبغة الفلورية بروبيديوم يوديد (PI). PI هو مركب قطبي يدخل الخلايا ذات أغشية الخلايا التالفة ويتفاعل مع الحمض النووي الذي ينبعث منه مضان أحمر (امتصاص 493 نانومتر ، انبعاث 630 نانومتر). نظرا لأن PI لا يقصد به الخلايا الحية ، فإنه يستخدم للكشف عن الخلايا الميتة في مجموعة سكانية.

1. حضانة PI
   1. قم بإعداد ، في وسط الاستزراع ، مخفف طازج بنسبة 1:10 من مخزون PI.
   2. لفحص امتصاص PI ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وارفع الملحق بعناية. أضف 13 ميكرولتر من PI إلى الوسط ، باستخدام ماصة P20 ، للحصول على تركيز نهائي قدره 2 ميكرومتر. حرك اللوحة ببطء قبل إعادة الملحق إلى مكانه. تأكد من عدم وجود فقاعات تحت الشرائح.
   3. ضع الشرائح مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
   4. تابع بروتوكول الكيمياء المناعية ، كما هو موضح في القسم التالي. قم بتغطية الألواح بالألمنيوم ، لأن PI حساس للضوء.

< p class = "jove_title" >3. الكيمياء المناعية

ملاحظة: في الكيمياء المناعية ، تم استخدام جسم مضاد خاص بالخلايا العصبية ، بالإضافة إلى الأجسام المضادة القادرة على التمييز بين الأنماط الظاهرية أثناء الراحة والتفاعل للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية ، لتقييم مدى موت الخلايا العصبية والانبهار في قشرة الأنف - الحصين ، شرائح عضوية شبيهة بالصرع.

1. تثبيت الأنسجة
   1. أخرج اللوحة من الحاضنة واستنشق الوسط. قم بتثبيت الشرائح باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة ساعة واحدة في RT ، عن طريق إضافة 1 مل من PFA أسفل الشرائح وفوقها ، باستخدام ماصة P1000.
   2. قم بإزالة PFA وأضف 1 مل من PBS. أضف أيضا PBS أسفل وفوق الشرائح.
   3. احتفظ بالشرائح عند 4 درجات مئوية ، في PBS ، حتى الاستخدام مرة أخرى. ضع دائما البارافيلم حول الألواح لتجنب الجفاف.
2. خطوات التلوين المناعي
   1. اغسل مرتين ، 10 دقائق في كل مرة ، باستخدام 1 مل من PBS.
   2. تحضير محلول النفاذية / الحجب الذي يحتوي على 1٪ Triton-X100 و 10٪ HS و 10٪ BSA في PBS. تحضير محلول BSA بنسبة 5٪.
   3. ارسم مستطيلين بالقلم الكارهة للماء (الشكل 2 أ). قطع الشرائح من الملحق (الشكل 2 ب) بشفرة حادة للغاية. ضع شريحتين لكل شريحة (الشكل 2C) وأضف 140 ميكرولتر من محلول النفاذية / الحجب في الجزء العلوي من كل شريحة ، باستخدام ماصة P200. احتضن لمدة 3 ساعات في RT.
   4. تمييع الأجسام المضادة الأولية لتخفيف العمل في 5٪ BSA في PBS. احتضان الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   5. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 4 ساعات في RT. من هذه الخطوة فصاعدا ، قم بحماية اللوحة من الضوء حيث يتم التعامل مع الفلوروفورات.
   6. ضع قطرة 50 ميكرولتر من محلول Hoechst أعلى كل شريحة واحتضانها لمدة 20 دقيقة في RT.
   7. يغسل بين الحضانات. اغسل دائما ثلاث مرات ، لمدة 10 دقائق في كل مرة ، باستخدام PBS-T.
   8. قم بإزالة Hoechst واغسله على النحو الموصى به.
   9. أضف 50 ميكرولتر من وسط التركيب في الجزء العلوي من كل شريحة. قم بتغطيتها بغطاء زجاجي وقم بإحاطتها بطلاء الأظافر (الشكل 2 د).
   10. اتركه يجف عند RT لمدة 24 ساعة.
   11. تصور التلوين المناعي تحت المجهر متحد البؤر. احتفظي بالشرائح الملطخة عند -20 درجة مئوية.

النتائج

الشكل 1: إجراء مفصل لإعداد شرائح النمط العضوي لقشرة الأنف والحصين. (أ) أخرج الدماغ من الرأس وضعه في GBSS المثلج مع توجيه السطح الظهري لأعلى. (ب) أدخل الملقط في المخيخ. افتح الدماغ من خلال خط الوسط وقم بإزالة الأنسجة الزائدة فوق الحصين. (ج) بملعقة مقطوعة أسفل الحصين ، كما هو موضح في الأسهم. (د) ضع كلا الحصين متجهين لأعلى ومتوازيا مع بعضهما البعض على ورق الترشيح وقم بق...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل ، قاع مخروطي الشكل كورنينج 430829 70٪ إيثانول مانويل فييرا ، Lda رقم 1170 Anti-NeuN (أرنب) فيرفن هاتف: 16712943 ثانية تمييع بنسبة 1:500 مكمل B-27™ (50X) ، خال من المصل ثيرمو فيشر العلمي 17504-044 شفرات لمقبض مشرط أدوات العلوم الدقيقة 10011-00 ألبومين مصل الأبقار (BSA) NZYTech MB04602 يستخدم 5٪ BSA لتخفيف الأجسام المضادة الأولية. أضف 0.5 جرام BSA في 10 مل PBS. نظام غرفة شريحة الدماغ / الأنسجة وارنر إنسترومنتس إدخالات زراعة الخلايا ، 30 مم ، PTFE محبة للماء ميليبور ساس PICM03050 مصدر الضوء البارد شوت كوالالمبور 300 ليد مجهر ليزر متحد البؤر زييس LSM 710 حاضنة تقليدية الحرارة العلمية هيريوس BB15 ، خط الوظائف اضبط على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون D (+) - مونوهيدرات الجلوكوز ميرك ميليبور 1.08342.1000 D- (+) - محلول الجلوكوز ، 45٪ في الماء سيغما جي 8769 ثنائي الصوديوم فوسفات الهيدروجين ثنائي الهيدرات ميرك ميليبور 1.06580.1000 تشريح المجهر / المكبر شركة ميجي تكنو المحدودة 122285 الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) مقترن ب Alexa Fluor 488 إنفيتروجين أ 21206 تمييع بنسبة 1:500 دومون # 5 ملقط ناعم بيولوجي إينوكس أدوات العلوم الدقيقة 11254-20 دومون # 5 ملقط قياسي إينوكس أدوات العلوم الدقيقة 11251-20 دومون # 7 ملقط قياسي دوموكسل أدوات العلوم الدقيقة 11271-30 ملقط دومون الطبي #7S منحنى قصير إينوكس أدوات العلوم الدقيقة 11273-22 محلول مخزون الجنتاميسين ، 50 مجم / مل ثيرمو فيشر العلمي 15750-037 محلول الملح المتوازن من جي (GBSS) الصناعات البيولوجية 01-919-1 أ أقطاب زجاجية منتجات علمية جي بي 150 إف -10 نصائح مستديرة محلية الصنع ماصات باستور زجاجية، 230 مم VWR الدولية 612-1702 محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ثيرمو فيشر العلمي 24020-091 مصل الحصان ، معطل بالحرارة (HS) حمض الهيدروكلوريك ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 26050-088 قلم مسعور ميرك ميليبور 1.09057.1000 INCU-Line IL10 داكو S200230-2 ملعقة القزحية منحنية وارنر إنسترومنتس BSC-HT Haas Top خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية أدوات العلوم الدقيقة 10092-12 ورق تنظيف العدسة هيراسفي النظام المنسق 12 محلول L-Glutamine 200 ملي مولار (Q) تيفن أنبوب صغير 0.5 مل ، PP ميرك ميليبور 1.05886.0500 أنبوب صغير 1.5 مل ، PP سارستدت 72,699 أنبوب دقيق 2.0 مل ، PP سارستدت 72.690.001 دولار نظارات غطاء المنظار ، 24 مم × 60 مم أداة سوتر النائب 285 طلاء الأظافر مارينفيلد 102242 Neurobasal-A متوسط (الدوري الاميركي للمحترفين) كليشيهات Opti-MEM® I مصل متوسط ثيرمو فيشر العلمي 10888-022 بارافورمالدهايد ، مسحوق ثيرمو فيشر العلمي 31985-047 مضخة تمعجية كيماويات VWR 2,87,94,295 محلول ملحي للفوسفات (PBS) جيلسون م 312 محاليل الفوسفات القياسية ، PO43- في الماء محلي الصنع. يستخدم PBS مع 0.5٪ Tween-20 (PBS-T) لغسل الشرائح أثناء فحص الكيمياء المناعية. طقم الماصات بي دي إتش أريستار 452232ج البلاتين 5 شفرات جيلسون P2 ، P10 ، P20 ، P100 ، P200 ، P1000 يوديد بروبيديوم (PI) سيجما ألدريتش P5405-250 جرام ورق ترشيح نوعي، سليلوز، صنف 1، 55 مم سيجما ألدريتش P4170-25 ملغ محلول المرق عند 1 مجم / مل في الماء. ورق ترشيح نوعي، سليلوز، درجة 1، 90 مم واتمان 1001-055 احتفاظ متوسط 11 ميكرومتر مقبض مشرط واتمان 1001-090 احتفاظ متوسط 11 ميكرومتر حقنة الأنسولين ذات الطرف الانزلاقي بدون إبرة 1 مل أدوات العلوم الدقيقة 91003-12 مقص طالب مستقيم شارب 12 سم مجموعة منتجات Astro Med Inc GRASS محفز S48 شرائح SuperFrost Plus™ Adhesion أدوات العلوم الدقيقة 91402-12 طبق ثقافة الأنسجة المعقم المعالج ب TC مقاس 60 × 15 مم ثيرمو فيشر العلمي J1800AMNZ لوحات معقمة 6 آبار معالجة TC كورنينج CORN430166 مفرمة المناديل شركة النظم الطبية تي سي -102 تريتون X-100 شركة ميككل لهندسة مختبرات المحدودة. MTC/2 ضبط على 350 ميكرومتر توين 20 BDH 14630 سيغما ص2287