مقايسة تجميع PolyQ لتحديد التأثير الوقائي العصبي لمركب في الديدان

الملخص

المصدر: Wang ، Q. et al. Caenorhabditis elegans كنظام نموذجي لاكتشاف المركبات النشطة بيولوجيا ضد السمية العصبية بوساطة البولي جلوتامين. J. Vis. Exp. (2021)

< p class = "jove_content">يصف هذا الفيديو طريقة في الجسم الحي لفحص الإمكانات الوقائية لمركبات اختبار الحماية العصبية في تقليل تراكم polyQ في خلايا عضلة جدار الجسم من الديدان الخيطية وتحسين السمية البروتينية المرتبطة بالتجميع.

البروتوكول

1. مقايسة تجميع PolyQ

1. تحضير الديدان الخيطية لمقايسة تجميع polyQ
   1. نقل 300-500 يرقات L1 متزامنة من AM141 إلى كل بئر من صفيحة 48 بئرا مع 500 ميكرولتر من وسط S يحتوي على OP50 (OD₅₇₀ من 0.7-0.8) و 5 مجم / مل من astragalan ، عادة بئر واحد لكل معالجة لنقطة زمنية واحدة.
   2. أغلق اللوحة بالبارافيلم واحتضانها عند 20 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة لمدة 24 و 48 و 72 و 96 ساعة.
   3. احصد الديدان الخيطية في أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل واغسلها بمحلول M9 >3 مرات بالطرد المركزي (1000 × جم لمدة دقيقة واحدة) لإزالة OP50 المتبقي. أعد تعليق الديدان الخيطية AM141 في المخزن المؤقت M9 ، واحتفظ بها جاهزة للحصول على الصور.
2. الحصول على صور الفلورسنت وتحليل البيانات
   ملاحظة: يتم تحليل البيانات تلقائيا باستخدام نظام التصوير عالي المحتوى هذا. إذا لم يكن جهاز التصوير الآلي متاحا ، فيمكن استخدام طريقة تقليدية لإعداد وسادة الاغاروز للحصول على الصور لتحقيق أداء مماثل باستخدام مجهر فلوري مشترك.
   1. انقل 10-15 ديدان خيطية إلى كل بئر في صفيحة 384 بئرا (الحجم النهائي 80 ميكرولتر لكل بئر). تعيين 10 آبار مكررة لكل علاج.
   2. أضف 10 ميكرولتر من أزيد الصوديوم 200 ملي مولار إلى كل بئر لشل الديدان الخيطية والسماح لها بالاستقرار في القاع (5-10 دقائق).
   3. ضع اللوحة في نظام تصوير عالي المحتوى للحصول على صور الفلورسنت (انظر جدول المواد للحصول على معلومات عن الجهاز والبرامج).
   4. افتح برنامج الحصول على الصور وقم بإعداد المعلمات التالية.
      1. افتح نافذة إعداد الحصول على اللوحة وأنشئ مجموعة تجارب واسم جديدين.
      2. حدد التكبير على أنه 2x، وتجميع الكاميرا على أنه 1، ونوع اللوحة كلوحة 384 بئر.
      3. تعيين الآبار والمواقع (موقع واحد) المراد زيارتها.
      4. حدد مرشح إيزوثيوسيانات الفلوريسئين (FITC) وقم بتمكين خيارات التركيز البؤري المستندة إلى الصور.
      5. اضبط التعريض الضوئي على 300 مللي ثانية
         ملاحظه: يمكن اختبار الإعدادات المذكورة أعلاه وتعديلها لتحسين معلمات التصوير.
      6. احفظ إعدادات الحصول على الصورة وانقر فوق الزر Acquire Plate للتشغيل.
   5. تحليل بيانات الصورة باستخدام برنامج تحليل الصور.
      1. افتح نافذة مراجعة بيانات لوحة وحدد لوحة الاختبار لتحليل الصورة.
      2. انقر نقرا مزدوجا فوق بئر الاختبار لعرض صورته.
      3. حدد عدد النوى كطريقة التحليل وانقر فوق الزر تكوين الإعدادات لإخراج نافذة للإعدادات التالية.
      4. حدد الصورة المصدر من قناة FITC وحدد الخوارزمية القياسية.
      5. اضبط معلمات تحليل الصورة على النحو التالي: الحد الأدنى التقريبي للعرض = 10 ميكرومتر (= 2 بكسل) ؛ الحد الأقصى التقريبي للعرض = 50 ميكرومتر (= 12 بكسل) ؛ الكثافة فوق الخلفية المحلية = 1,000-2,000 مستوى رمادي.
      6. اختبر الإعدادات الحالية لتحسين طريقة التحليل.
      7. احفظ الإعدادات وقم بتشغيل التحليل على جميع الآبار.
         ملاحظه: يستغرق الأمر ~ 20 دقيقة لإنهاء التحليل للوحة واحدة بسعة 384 بئرا.
      8. تصدير إجمالي النوى كإجمالي عدد مجاميع Q40::YFP في كل بئر.
   6. احسب عدد الديدان الخيطية في كل بئر.
   7. احسب متوسط عدد مجاميع Q40 :: YFP لكل ديدان خيطية في كل مجموعة ، وقم بتطبيق منحنى غير خطي مناسب للبيانات من كل نقطة زمنية.
   8. احسب مؤشر التثبيط:
      مؤشر التثبيط = (_{N تحكم} - N_عينة) / Ncontrol
      حيث N_control و_{N sample} هما متوسط عدد مجاميع Q40:: YFP في مجموعات التحكم والمعالجة ، على التوالي.

المواد