فحص سلوك التجنب الكيميائي في الديدان المعدلة وراثيا باستخدام مقايسة التجنب التناضحي

Abstract

المصدر: Wang، Q. et al.، Z. Caenorhabditis elegans كنظام نموذجي لاكتشاف المركبات النشطة بيولوجيا ضد السمية العصبية بوساطة البولي جلوتامين. J. Vis. إكسب. (2021).

يصف هذا الفيديو مقايسة التجنب التناضحي لفحص سلوك التجنب الكيميائي في نموذج الدودة المعدلة وراثيا. يتم اختبار سلوك التجنب في صفيحة في وجود حاجز تناضحي عالي وجاذب كيميائي. تنجذب الديدان التي تفقد وظيفيا للخلايا العصبية بواسطة الجاذب الكيميائي ، وتعبر الحاجز التناضحي العالي ، وتصاب بالشلل في منطقة المصيدة بسبب محلول التخدير.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

ملاحظة: انظر الجدول 1 للحصول على وصفات الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد لاختبار Caenorhabditis elegans

1. صيانة سلالات C. ايليجانس
   1. الحصول على C. ايليجانس (AM141 و HA759) والإشريكية القولونية (OP50 و NA22) سلالات (انظر جدول المواد).
   2. حافظ على الديدان الخيطية على صفيحة وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) المصنفة ب E. coli OP50 عند 20 درجة مئوية ل AM141 أو 15 درجة مئوية ل HA759.
2. تحضير الإشريكية القولونية OP50 المزرعة البكتيرية
   1. اختر مستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية OP50 من صفيحة خط لوريا-بيرتاني (LB) وقم بتلقيحها في 50 مل من ثقافة LB السائلة.
   2. احتضان بكتيريا OP50 في شاكر عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة حتى كثافة بصرية ~ 0.5 عند 570 نانومتر (OD₅₇₀).
   3. قم بتخزين المزرعة البكتيرية OP50 في درجة حرارة 4 درجات مئوية واستخدمها في غضون أسبوعين.
3. تحضير ألواح NGM ببكتيريا OP50
   1. أضف 20 جم من أجار ، و 2.5 جم من البيبتون ، و 3.0 جم من كلوريد الصوديوم ، و 975 مل من الماء منزوع الأيونات إلى زجاجة قابلة للتعقيم بسعة 1 لتر. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   2. ضع زجاجة أجار NGM السائلة على المقعد لتبرد إلى ~ 60 درجة مئوية ، ثم أضف محاليل المرق المعقمة التالية: 1 مل من 1 M CaCl₂ ، 1 مل من 1 M MgSO₄ ، 1 مل من 5 مجم / مل من الكوليسترول ، و 25 مل من فوسفات البوتاسيوم 1 M (درجة الحموضة 6.0).
   3. صب 20 مل من NGM في طبق بتري معقم مقاس 90 مم ، واترك الأطباق على المقعد لتبرد وتتجمد. حافظ على الألواح رأسا على عقب واتركها تجف على المقعد في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.
   4. قم بتوزيع 200 ميكرولتر من المزرعة البكتيرية OP50 على كل صفيحة NGM ووزعها بالتساوي باستخدام قضيب طلاء زجاجي معقم. أغلق الأغطية واحتضن الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
   5. قم بتخزين أطباق NGM المصنفة ب OP50 في صندوق بلاستيكي بغطاء في درجة حرارة الغرفة واستخدمها في غضون أسبوعين.
4. إعداد السكان المتزامنين مع العمر C. ايليجانس
   1. اجمع الديدان الخيطية البالغة الحاملة في أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 1 دقيقة. اغسل ثلاث مرات وأعد تعليق الديدان الخيطية في المخزن المؤقت M9.
   2. أضف كمية متساوية من محلول التبييض وحرك برفق لمدة 3-5 دقائق. راقب التبييض كل 15 ثانية تحت مجهر تشريح.
      ملاحظه: يجب تحضير محلول التبييض طازجا قبل الاستخدام عن طريق خلط كميات متساوية من 10٪ NaOCl و 1 M هيدروكسيد الصوديوم (الجدول 1).
   3. بمجرد كسر معظم الديدان الخيطية ، أوقف عملية الهضم عن طريق التخفيف باستخدام المخزن المؤقت M9. جهاز طرد مركزي بسرعة لإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت M9 لتكرار الغسيل ثلاث مرات.
   4. أعد تعليق الحبيبات في وسط S. دع بقايا الديدان الخيطية تستقر بالجاذبية لمدة 2-3 دقائق بينما يبقى البيض في المادة الطافية.
   5. استنشق المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم جديد. اجمع البيض عن طريق الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 1 دقيقة.
   6. تخلص من ~ 80٪ من المادة الطافية وانقل البيض إلى قارورة معقمة تحتوي على 20 مل من وسط S. ضع القارورة في شاكر واحتضن البيض طوال الليل بدون طعام عند 120 دورة في الدقيقة للحصول على الديدان الخيطية L1 المتزامنة.

2. فحوصات السمية العصبية بوساطة PolyQ

1. معالجة المطثية ايليجانس بعينات الاختبار
   1. لتحضير الديدان الخيطية لمقايسة السمية العصبية polyQ ، قم بنقل 300-500 يرقات L1 متزامنة من HA759 إلى كل بئر من صفيحة 48 بئرا مع 500 ميكرولتر من وسط S يحتوي على OP50 (OD570 من 0.7-0.8) و 5 مجم / مل من astragalan ، عادة ما تكرر ثلاثة آبار لكل معالجة.
   2. أغلق اللوحة بالبارافيلم واحتضانها عند 15 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة لمدة 3 أيام.
   3. اجمع الديدان الخيطية عن طريق الطرد المركزي واغسلها 3-5 مرات باستخدام المخزن المؤقت M9. أعد تعليق الديدان الخيطية في المخزن المؤقت M9 لاستخدامها في فحوصات بقاء الخلايا العصبية وتجنبها.
2. مقايسة التجنب التناضحي
   1. قسم صفيحة NGM خالية من الطعام (9 سم) إلى مناطق طبيعية (N) ومنطقة فخ (T) بواسطة خط 8 M glycerol (~ 30 μL) في المنتصف. انشر خط أزيد الصوديوم 200 ملي مولار (~ 20 ميكرولتر) على بعد ~ 1 سم من خط الجلسرين لشل الديدان الخيطية التي تعبر حاجز الجلسرين إلى المنطقة T.
   2. انقل ~ 200 ديدان خيطية لكل منها إلى المنطقة N من ثلاث لوحات مكررة لكل مجموعة. أضف قطرة من 1٪ بوتانديون (~ 2 ميكرولتر) على المنطقة T (1 سم من حافة اللوحة) لجذب الديدان الخيطية. غطي غطاء طبق بتري على الفور ، واحتضنه على حرارة 23 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
   3. سجل عدد الديدان الخيطية في منطقتي N و T تحت المجهر. احسب مؤشر التجنب باستخدام eq.
      مؤشر التجنب = N / (T + N)
      حيث N و T هما عدد الديدان الخيطية في منطقتي N و T ، على التوالي. يتم تقديم البيانات كوسيلة ± الانحراف المعياري (SD) لثلاث تكرارات ، تمثل >3 تجارب مستقلة.
   4. قم بإجراء اختبار t غير مقترن ثنائي الذيل لمقارنة البيانات من مجموعات الاستراغالان ومجموعات التحكم.

< p class = "jove_content" >الجدول 1:

حل تعليمات التحضير خزن 1 M CaCl₂ 111 جم كلوريد العاصمة₂ يحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT) أضف dH₂O إلى 1 لتر الأوتوكلاف 1 م فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 6.0) 108.3 جم كيلو هيلو هرتز₂نقطة₄ Store في RT 35.6 ك₂HPO₄ أضف dH₂O إلى 1 لتر الأوتوكلاف 1 م MgSO₄ 246 جم MgSO₄ · 7 ساعات₂O Store في RT أضف dH₂O إلى 1 لتر الأوتوكلاف الكوليسترول في الإيثانول (5 مجم / مل) 0.5 جرام كوليسترول يحفظ في -20 درجة مئوية أضف الإيثانول إلى 100 مل لا تفعل الأوتوكلاف! 1 M سترات البوتاسيوم (درجة الحموضة 6.0) أضف 10.0 جم أحادي هيدرات حامض الستريك Store في RT أضف 146.75 جم من حامض الستريك ثلاثي البوتاسيوم أحادي الهيدرات أضف dH₂O إلى 1 لتر الأوتوكلاف محلول المعادن النزرة 0.93 جرام ثنائي الصوديوم EDTA تخزينها في الظلام في RT 0.345 جرام FeSO₄ · 7 ساعات₂درجة 0.1 جم MnCl₂ · 4 ساعات₂O 0.145 جم ZnSO₄ ·7 ساعات₂O أضف 0.0125 جم CuSO₄ · 5 ساعة₂O أضف dH₂O إلى 500 مل الأوتوكلاف 1 م هيدروكسيد الصوديوم 4 جم هيدروكسيد الصوديوم Store at RT أضف dH₂O إلى 100 مل محلول التبييض 0.5 مل من 1 م هيدروكسيد الصوديوم تحضير طازجة قبل الاستخدام 0.5 مل من 10٪ NaOCl M9 المخزن المؤقت 5 جم كلوريد الصوديوم Store في RT 3 جم كيلو هيلو_{هرتز 2}PO₄ 6 جم Na₂HPO₄ أضف dH₂O إلى 1 لتر الأوتوكلاف أضف 1 مل من 1 م MgSO₄ S قاعدي 5.85 جرام كلوريد الصوديوم Store في RT 6.0 جم كيلو هيلو هرتز₂PO₄ 1.0 غ K₂HPO₄ أضف dH₂O إلى 973 مل الأوتوكلاف ، ويبرد إلى ~ 60 درجة مئوية أضف 1 مل من 5 مجم / مل من الكوليسترول في الإيثانول S متوسط S قاعدية Store في RT أضف 3 مل من 1 م CaCl₂ أضف 3 مل من 1 م MgSO₄ أضف 10 مل من سترات البوتاسيوم 1 م أضف 10 مل من محلول المعادن النزرة تم تعقيم جميع المكونات ، لا يتم التعقيم 5 مجم / مل من استراغلان 0.1 جرام استراغلان يخزن في حصص عند -80 درجة مئوية أضف 20 مل من S medium تصفية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر 200 ملي مولار من أزيد الصوديوم 1.3 جم NaN₃ يخزن في 4 درجات مئوية أضف 100 مل من S medium 8 م جلسرين 73.67 جرام جلسرين Store at RT أضف dH₂O إلى 100 مل 10٪ مخزون بوتانيديون امزج 10 ميكرولتر من البيوتانديون مع 90 ميكرولتر من dH₂O تخزين في RT 1٪ بوتانيديون أضف 10 ميكرولتر من مخزون البيوتانيديون إلى 90 ميكرولتر من الهيدروكسيون₂O تخزين في RT 1 لتر من ثقافة لوريا بيرتاني (LB) 10 غ كلوريد الصوديوم Store في RT 10 جم تربتون 5 جم مستخلص الخميرة أضف dH₂O إلى 1 لتر الأوتوكلاف

Materials