< p class = "jove_title" >1. فحص الجرح:
< p class = "jove_content" >
(يوضح الشكل 1 النموذج التخطيطي للمقايس)
- اسمح لإدخالات الخلايا O9-1 وآبار غرفة الخلايا C2C12 بالالتصاق والتكاثر في الحاضنة حتى تصل كلتا الخليتين إلى ~ 70-80٪ قبل متابعة هذا الجزء من البروتوكول. إذا نمت الخلايا >90٪ ملتقى ، فلا تتابع مقايسة الخدش ، لأن الخلايا ستنفصل فقط عن البئر.
- قم بتسخين 1x PBS و C2C12 المتوسط عن طريق وضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- قم بإزالة الوسط الطافي من حجرة C2C12 جيدا واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS. قم بإزالة 1x PBS وخدش الخلايا على الفور بطرف ماصة P10 معقم.
- مرر طرف الماصة المعقم P10 بإحكام في اتجاه واحد ليمتد على طول أو عرض الطبقة الأحادية للخلية بالكامل (على سبيل المثال، من اليمين إلى اليسار ومن أعلى إلى أسفل). تأكد من خدش كل بئر تحتوي على خلايا مرة واحدة فقط.
ملاحظه: لتحسين نتائج الخدش ، قم بخدش الآبار من ظروف تجريبية مختلفة بمستوى مماثل من التقاء. للقيام بذلك ، تأكد من أن كل بئر مكون من 4 غرف يحتوي على خلايا لكل حالة تجريبية مطلوبة (على سبيل المثال ، التحكم السلبي جيدا # 1 ، التحكم الإيجابي # 2). بالإضافة إلى ذلك، استخدم ماصة P10 معقمة جديدة لكل خدش واستخدم قدرا مماثلا من القوة على الماصة في كل مرة. لا تحاول إنشاء أكثر من خدش واحد في كل بئر.
- بعد الخدش ، أضف بسرعة 1 مل من 1x PBS مرة أخرى إلى البئر باستخدام طرف ماصة P1000. كرر هذه العملية لكل بئر سيتم خدشه.
ملاحظه: بالنظر إلى التباين المرتبط بكل خدش ، يوصى باستخدام آبار متعددة (ن = 3) لإنشاء الجرح في كل حالة تجريبية. اعمل على وجه السرعة لأنه من الأهمية بمكان تقليل المدة التي تكون فيها الخلايا بدون 1x PBS أثناء هذه الخطوات. بعد إزالة 1x PBS من كل بئر ، يجب ألا يستغرق المرء أكثر من 5 ثوان لتوليد جرح في كل بئر.
- بعد إنشاء جرح وإضافة 1x PBS مرة أخرى إلى كل بئر ، قم بتصوير الخدش باستخدام مجهر مقلوب ساطع واستخدم هذه الصورة كحجم الجرح الأساسي (الوقت 0). لالتقاط الصور ، قم بتنفيذ الخطوات التالية:
- قم بتشغيل الكمبيوتر والمجهر (انظر جدول المواد) بالضغط على زر الطاقة. ضع شريحة الغرفة على المسرح وقم بتدوير قرص الهدف إلى تكبير 5x.
- افتح برنامج التصوير (انظر جدول المواد) بالنقر المزدوج فوق رمز البرنامج على سطح مكتب الكمبيوتر. انقر فوق علامة التبويب الكاميرا على الشاشة الرئيسية للبرنامج. انقر فوق الزر Live لتصور الخلايا الموجودة في علامة التبويب AxioCam IC.
- تأكد من سحب مرشح الضوء بالكامل للسماح للضوء بالمرور إلى الكاميرا وشاشة الكمبيوتر. حرك و/أو قم بتدوير شريحة الغرفة يدويا لوضع منطقة الجرح في وسط الصورة الحية على علامة التبويب AxioCam IC.
- لالتقاط الصور، انقر فوق snap لفتح علامة تبويب جديدة بجوار علامة التبويب AxioCam IC التي تحتوي على الصورة.
- لحفظ هذه الصورة الثابتة، انقر فوق ملف في الجزء العلوي الأيسر من الصفحة الرئيسية للبرنامج | حفظ باسم | أدخل اسم الملف في مربع اسم الملف. احفظ الشكل بتنسيق صورة Carl Zeiss (* .czi) (الإعداد الافتراضي) ، وحدد سطح المكتب على الشريط الموجود على اليسار لحفظ الملف على سطح المكتب كملف .czi ، والذي لا يمكن فتحه إلا في برنامج Zen lite 2012.
- لحفظ الصورة ك.tiff، انقر فوق ملف | حفظ باسم | أدخل اسم الملف في مربع اسم الملف. احفظ الشكل كملف صورة مميز (*.tiff) بالنقر فوق الزر حفظ كنوع وتحديد *.tiff من القائمة المنسدلة.
ملاحظه: يمكن فتح تنسيق .tiff في أي برنامج لمعالجة الصور.
- أعد وضع شريحة الغرفة يدويا لالتقاط 2-3 صور أخرى في نقاط أخرى من الجرح في نفس البئر.
ملاحظه: في المجموع ، سينتج عن ذلك 3-4 صور غير متداخلة وعالية التكبير للجرح في كل بئر.
- قم بإزالة 1x PBS من كل بئر وأضف 1 مل من C2C12 متوسط.
ملاحظه: كن حذرا من عدم الماصة بقوة شديدة عند إزالة أو إضافة المحاليل إلى الغرفة جيدا بعد تكوين الجرح ، فقد يتسبب ذلك في انفصال الخلايا عن الغرفة جيدا. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإمالة الغرفة جيدا بحيث يمكن إجراء الشفط وإعادة إدخال المحاليل في زوايا كل بئر لتقليل اضطراب الخلية أحادية الطبقة.
- قم بتجميع نظام الزراعة المشتركة لإدخال البئر عن طريق وضع الإدخالات التي تحتوي على خلايا O9-1 يدويا في كل بئر من بئر الغرفة. ادفع الإدخالات برفق لأسفل في البئر بحيث يكون الجزء السفلي من الملحق فوق خلايا C2C12 الأساسية مباشرة. أعد تركيبات إدراج البئر إلى الحاضنة.
ملاحظه: لا تسمح لقاع الملحق بلمس خلايا C2C12 الأساسية وتعطيلها ميكانيكيا.
- اسمح للخلايا بالهجرة لمدة 9-12 ساعة. لتحديد وقت الهجرة الأمثل ، افحص الخلايا بعد 6 ساعات من تكوين الجرح ، ثم كل 2-3 ساعات بعد ذلك. قم بإنهاء التجربة عندما تبدأ الخلايا في ظروف التحكم أو التحكم الإيجابي في تغطية الجرح بالكامل.
ملاحظه: نظرا لطبيعة عدم الاتصال للبناء ، لا يلزم إزالة الملحق العلوي من الآبار عند التحقق من تقدم الانتقال الفاصل الزمني. سيتم ملاحظة التباين المهاجر اعتمادا على عوامل مثل أنواع الخلايا المستخدمة في هذا الاختبار ، والكثافة الخلوية في وقت توليد الجرح ، وعرض الجرح الذي تم إنشاؤه ، والظروف التجريبية للخلايا التي تم التلاعب بها (على سبيل المثال ، ضربة قاضية للجين ، إضافة البروتين المؤتلف). وينبغي تحديد تركيزات هذه الكواشف تجريبيا بتوجيه من توصيات الشركة المصنعة.
