مقالة منهجية

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم للتحقق من اقتران الأجسام المضادة ومستضد المقترنة كيميائيا

1.2K مشاهدات

⸱

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

المصدر: Volckmar، J. et al.، الاقتران الكيميائي لجسم مضاد موجه ب DEC-205 منقى مع بروتين كامل الطول لاستهداف الخلايا المتغصنة للفأر في المختبر وفي الجسم الحي. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو الكشف عن مجمعات الأجسام المضادة والمستضد المترافقة كيميائيا عبر تقنية المقايسة الممتزة المناعية المرتبطة بإنزيم الساندويتش ، أو تقنية ELISA. يرتبط الجسم المضاد الذي تم التقاطه بالحاتمة المحددة لمستضد الجسم المضاد المترافق ، والذي يمكن تصوره لاحقا باستخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط بالإنزيم.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إنتاج αDEC-205 من خط خلايا الورم الهجين NLDC-145

  1. لإنتاج الأجسام المضادة ، قم بإذابة خلايا NLDC-145 المحفوظة بالتبريد التي تنتج αDEC-205 عند 37 درجة مئوية في حمام مائي. قم بتوسيع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. ستكون هناك حاجة إلى زجاجتين مقاس 75 سم2 للمضي قدما في إنتاج الأجسام المضادة. يجب تنفيذ إجراءات زراعة الخلايا في خزانة أمان لضمان ظروف عمل آمنة ومنع تلوث الثقابات.
    1. أعد تعليق 1 مل من الخلايا المذابة (1 × 106 - 5 × 106 خلايا / مل) في 9 مل من وسط ISF-1 مكمل ب 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية) في قارورة زراعة الخلية (25 سم2). ضع القارورة أفقيا في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    2. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، حتى التقاء 70٪. يجب أن يتحقق ذلك عادة بعد 24 - 48 ساعة.
    3. بمجرد أن تتلاقى الخلايا بنسبة 70٪، انقل معلق خلية NLDC-145 الكامل (10 مل) إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل باستخدام وحدة تحكم في الماصة مع ماصة في نطاق حجم يتراوح من 1-10 مل. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      4. ما
    4. قبل التسخين ISF-1 متوسط إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي وإعادة تعليق الحبيبات في 12 مل من وسط ISF-1 مكمل بنسبة 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. انقل معلق الخلية المعلق إلى قارورة زراعة خلية جديدة (75 سم2).
    5. زراعة الخلايا وتوسيعها في وسط ISF-1 مكمل ب 1٪ بنسلين / ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، حتى يلتقي 70٪ و 99٪ قابل للحياة. يجب أن يتحقق ذلك عادة بعد 48 - 72 ساعة.
    6. قسم الخلايا إلى قارورتين مقاس 75 سم2. للقيام بذلك ، قم أولا بغسل قاع قارورة ثقافة الخلية / سطح المزرعة بتعليق الخلية لإزالة جميع خلايا NLDC-145 من السطح. انقل 6 مل من معلق الخلية NLDC-145 إلى واحدة من زجاجتين طازجتين مقاس 75 سم2 وأضف وسيط ISF-1 الدافئ مسبقا مع 1٪ بنسلين / ستربتومايسين حتى 12 مل
      ملاحظه: لا تجدد وسط زراعة الخلية لأن خلايا NLDC-145 قد كيفت الوسط. انقل الخلايا مع وسطها واملأ المزرعة حتى الحجم المطلوب بوسط جديد. هذا أمر بالغ الأهمية للبقاء وإنتاج الأجسام المضادة القصوى بواسطة خلايا NLDC-145.
    7. قم بتوسيع مزارع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، حتى حوالي 70٪ ملتقى والذي يتم تحقيقه بشكل عام بعد 48 - 72 ساعة.
    8. بمجرد أن تتجمع الخلايا بنسبة 70٪ ، انقل 10 مل من معلق الخلية NLDC-145 الموسع من كل زجاجة من زجاجات 75 سم2 إلى زجاجة أسطوانية واحدة PETG (البولي إيثيلين تيريفثاليت جلايكول) (1،050 سم2). لهذا الغرض، اغسل قاع قارورة زراعة الخلية / سطح المزرعة بتعليق الخلية لإزالة جميع الخلايا من السطح باستخدام وحدة تحكم في الماصة وماصة سعة 10 مل.
    9. أضف 140 مل من وسيط ISF-1 المكمل ب 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) مباشرة من الزجاجة المتوسطة إلى كل زجاجة من زجاجات NLDC-145 التي تحتوي على زجاجات أسطوانية تملأها حتى علامة 150 مل.
      ملاحظه: انظر الملاحظة الواردة في الخطوة 1-1-6.
    10. استزراع زجاجات الأسطوانة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، و 25 طلقة / دقيقة لمدة ثلاثة أيام.
    11. أضف 150 مل من وسيط ISF-1 المكمل ب 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) إلى كل زجاجة من زجاجات NLDC-145 التي تحتوي على زجاجات أسطوانية تملأها حتى علامة 300 مل.
    12. استزراع زجاجات الأسطوانة التي تحتوي الآن على 300 مل مزرعة لكل منها عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، و 25 طلقة / دقيقة لمدة ثلاثة أيام أخرى.
    13. أضف 100 مل أخرى من وسيط ISF-1 مكمل بنسبة 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) إلى كل زجاجة من زجاجات NLDC-145 المحتوية على ، وبالتالي ملئها حتى علامة 400 مل.
    14. استزراع زجاجات الأسطوانة التي تحتوي الآن على 400 مل مزرعة لكل منها عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، و 25 طلقة / دقيقة لمدة سبعة أيام أخرى.
      ملاحظه: خلال هذا الأسبوع ، تصبح الثقافة كثيفة جدا (تصل إلى 95٪ كثافة) وتقل قابليتها للحياة (تصل إلى أقل من 50٪) ، مما يتيح أقصى إطلاق للأجسام المضادة.
  2. لتنقية αDEC-205 من المادة الطافية للثقافة ، اسكب معلق الخلية NLDC-145 (من كلتا الزجاجتين الدوارة) مباشرة في زجاجات الطرد المركزي المعقمة سعة 500 مل.
    ملاحظه: يجب جمع حجم إجمالي قدره 800 مل من المزرعة.
    1. جهاز الطرد المركزي للثقافة لمدة 30 دقيقة عند 8,600 × جم و 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا والحطام.
    2. اجمع المواد الطافية ، وتخلص من الكريات ، وقم بتجميع المواد الطافية في زجاجة كاشف معقمة.
      ملاحظه: يمكن البدء في تنقية αDEC-205 على الفور (الخطوة 2.) أو يمكن تخزين المادة الطافية على المدى القصير عند 4 درجات مئوية.
فئة

2. تنقية الجسم المضاد αDEC-205 من الطاف لخلية NLDC-145

ملاحظة: من المادة الطافية لخلية NLDC-145 ، يتم تنقية αDEC-205 باستخدام عمود البروتين G Sepharose (قابل لإعادة الاستخدام). أبعاد العمود 15 مم × 74 مم و 5 مل من البروتين G Sepharose معبأة لكل عمود.

  1. لتحضير وغسل عمود البروتين G Sepharose ، ضع سدادة مطاطية محكمة الإغلاق على الفتحة العلوية لعمود البروتين G Sepharose. ثقب السدادة المطاطية بقنية معقمة (20 جم × 1 1/2 بوصة ، 0.90 × 40 مم).
    1. قم بتوصيل حقنة سعة 10 مل بأحد القنيات وأنبوب سيليكون مرن (طوله حوالي 100 سم وقطر 2.5 - 3 مم) بموصل أنبوب بالقنية الثانية.
      ملاحظه: هيكل الحقنة / السدادة المطاطية قابل لإعادة الاستخدام ويوفر فراغا ينتج عنه تدفق مستمر للحجم الكبير من المادة الطافية للثقافة إلى عمود البروتين G Sepharose. تحقيقا لهذه الغاية ، اسحب مكبس المحقنة قليلا لضمان تدفق السوائل المستمر في الخطوات التالية.
    2. اغسل العمود ب 50 مل من حمض الخليك الجليدي 0.1 متر (درجة الحموضة 2) لإزالة الجسم المضاد المتبقي المحتمل من أي تنقية سابقة للأجسام المضادة. ضع نهاية أنبوب السيليكون في زجاجة الكاشف المملوءة بحمض الخليك الجليدي 0.1 متر (درجة الحموضة 2). نتيجة للفراغ المستحث ، يمر 50 مل من حمض الخليك الجليدي 0.1 M (الرقم الهيدروجيني 2) بالتنقيط عبر عمود البروتين G Sepharose.
      ملاحظة: يجب تخزين حمض الخليك الجليدي 0.1 متر (الرقم الهيدروجيني 2) في زجاجة كاشف أو ملؤه حديثا في كوب.
    3. اغسل العمود بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بسعة 100-200 مل ضع نهاية أنبوب السيليكون في زجاجة كاشف مملوءة ب PBS أو دورق دع 100-200 مل من PBS يعمل بالتنقيط عبر عمود البروتين G Sepharose.
  2. لتنقية الأجسام المضادة من المادة الطافية NLDC-145 ، قم بتحميل 800 مل من المادة الطافية NLDC-145 (التي تم الحصول عليها من الخطوة 1.2.2.) على العمود. ضع نهاية أنبوب السيليكون في زجاجة الكاشف المملوءة بالمواد الطافية NLDC-145. دع 800 مل NLDC-145 طافي يعمل بالتنقيط عبر العمود.
    1. اغسل العمود ب 500 مل من PBS. ضع نهاية أنبوب السيليكون في زجاجة كاشف مملوءة ب PBS أو دورق دع 500 مل من PBS يعمل بالتنقيط عبر العمود.
    2. للشطف، استخدم 20 أنبوبا سعة 1.5 مل وماصة 100 ميكرولتر من 1.5 م Tris-HCl (درجة الحموضة 8.8) في كل أنبوب سعة 1.5 مل. قم بإزالة السدادة المطاطية من العمود والماصة 1 مل من 0.1 M glycine (درجة الحموضة 3) إلى الحجرة العلوية لعمود البروتين G Sepharose لإزالة الجسم المضاد من العمود. اجمع التدفق مباشرة مثل الشطف في أحد الأنابيب المعدة سعة 1.5 مل.
    3. كرر خطوة الشطف (2.2.2.) لجميع الأنابيب ال 20 (1.5 مل).
    4. تحديد الكثافة الضوئية لجميع كسور الشطف عند 280 نانومتر (OD280) باستخدام مقياس الطيف الضوئي من أجل تحديد الكسور المحتوية على الجسم المضاد.
      ملاحظه: استخدم كسر الشطف الأول كفارغ.
    5. تجميع جميع الكسور التي تحتوي على OD280 أكبر من 0.5 (حوالي 10 كسور).
    6. قم بتخزين عمود البروتين G Sepharose المملوء ب 20٪ إيثانول عند 4 درجات مئوية.
  3. غسيل الكلى للعمليات المجمعة مقابل 1000 مل PBS (في دورق 2000 مل) عند 4 درجات مئوية طوال الليل باستخدام أنابيب غسيل الكلى مع قطع الوزن الجزيئي (MWCO) من 12 - 14 كيلو دالتون.
    1. قطع أنبوب غسيل الكلى إلى قطع 20 سم. قم بغلي أنبوب غسيل الكلى في 500-800 مل من 10 ملي EDTA (درجة الحموضة 7.5) لمدة 30 دقيقة في دورق باستخدام لوح تسخين لإزالة التلوث. تخلص من محلول EDTA 10 ملي مولار (درجة الحموضة 7.5) واغلي أنبوب غسيل الكلى في ماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق < / > ملاحظه: يمكن استخدام أنابيب غسيل الكلى مباشرة أو تخزينها في محلول أزيد الصوديوم 0.01٪ (NaN3) / H2O عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام التالي.
    2. أغلق الجزء السفلي من أنبوب غسيل الكلى بإغلاق مناسب لأنبوب غسيل الكلى / مشبك مفصلي من قطعة واحدة وقم بسحب شطف الجسم المضاد بعناية في أنبوب غسيل الكلى. أغلق الجزء العلوي من أنبوب غسيل الكلى بمشبك ثان.
    3. قم بتثبيت المشبك العلوي لأنبوب غسيل الكلى في حامل عائم ، وضعه مع قضيب تحريك مغناطيسي في الدورق المملوء ب PBS ، وضع الدورق على محرك مغناطيسي.
    4. غسيل الكلى طوال الليل مع التحريك على حرارة 4 درجات مئوية.
  4. لزيادة تركيز αDEC-205 ، قم بتحميل غسيل الكلى الكامل إلى مكثف الطرد المركزي ب 10 كيلو دالتون MWCO. افتح مشبك واحد من الأنبوب وقم بإخراج غسيل الكلى الكامل بعناية من أنبوب غسيل الكلى إلى مكثف الطرد المركزي (10 كيلو دالتون MWCO).
    ملاحظه: لا تلمس الجزء السفلي من المكثف بطرف الماصة.
    1. جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 693 × جم (2,000 دورة في الدقيقة) و 4 درجات مئوية.
    2. قم بتحميل مكثف الطرد المركزي ب 10 مل من PBS وجهاز الطرد المركزي عند 693 × جم (2,000 دورة في الدقيقة) و 4 درجات مئوية حتى يكون الحجم النهائي لمحلول الأجسام المضادة المتبقي 1-1.5 مل
      ملاحظه: إذا لزم الأمر ، كرر خطوة الطرد المركزي 2.4.1. للتكيف مع الكمية المطلوبة.
    3. باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، حدد الكثافة البصرية لمحلول αDEC-205 المركز عند 280 نانومتر (OD280). استخدم PBS كفارغ.
    4. احسب تركيز αDEC-205 باستخدام الصيغة التالية:
      التركيز [ملغم / مل] = OD280 / 1.4.
    5. قم بتصفية محلول αDEC-205 باستخدام وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظه: يمكن أيضا تنقية αDEC-205 من الطافي الطافي لخلية الورم الهجين NLDC-145 عن طريق FPLC (كروماتوغرافيا سيلي البروتين السريع). يمكن تخزين αDEC-205 المنقى عند 4 درجات مئوية أو عند -18 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
فئة

3. الاقتران الكيميائي ل OVA إلى αDEC-205

< p class = "jove_content" >ملاحظة: مطلوبة نسبة 0.5 مجم من بروتين OVA إلى 2.5 مجم αDEC-205 (1: 5) للاقتران الكيميائي الأمثل. ومع ذلك ، يمكن أن تختلف هذه النسبة باختلاف البروتينات والأجسام المضادة الأخرى وتحتاج إلى تحسينها للاقترانات البديلة. يتم إجراء تقليل روابط ثاني كبريتيد لبروتين OVA من خلال الحضانة باستخدام 30 ملي مولار TCEP-HCl ، مما يعرض مجموعات السلفهيدريل للاقتران الكيميائي إلى αDEC-205 و 240 ميكرولتر من TCEP-HCl مطلوبة في الخطوة 3.2. ويفضل إجراء كلتا الخطوتين ، التخفيض الناجم عن TCEP ل OVA (الخطوة 3.1.) وتنشيط sulfo-SMCC ل αDEC-205 (الخطوة 3.2.) بالتوازي.

  1. قم بإعداد محلول TCEP-HCl 125 ملي (درجة الحموضة 7.0). قم بوزن الكمية المطلوبة من TCEP-HCl وقم بإذابة TCEP-HCl في قاعدة تريس 0.9 M (درجة الحموضة 8.8). استخدم شرائط مؤشر الأس الهيدروجيني لاختبار الرقم الهيدروجيني لمحلول TCEP-HCl 125 ملي مولار (والذي يجب أن يكون محايدا) وضبط الأس الهيدروجيني باستخدام قاعدة تريس (الرقم الهيدروجيني 8.8).
    1. ماصة 200 ميكرولتر محلول بروتين OVA (يحتوي على 0.5 ملغ OVA) في أنبوب معقم سعة 1.5 مل. أضف 240 ميكرولتر 125 ملي مولار TCEP-HCl و 560 ميكرولتر من الماء المعقم فائق النقاء إلى بروتين OVA باستخدام ماصة إلى تركيز نهائي يبلغ 0.5 مجم / مل من بروتين OVA و 30 ملي مولار TCEP-HCl (OVA / TCEP-HCl).
      ملاحظة: يتم إذابة 2.5 مجم من EndoGrade OVA (المجفف بالتجميد) في 1 مل PBS مما ينتج عنه محلول 2.5 مجم / مل OVA.
    2. احتضان OVA / TCEP-HCl الناتج في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة
      ملاحظه: لا تقم بتمديد خطوة الحضانة هذه.
  2. لتنشيط αDEC-205 للاقتران ، قم بإذابة 2 مجم من السلفو-SMCC في 100 ميكرولتر من الماء عالي النقاء.
    ملاحظه: Sulfo-SMCC عرضة للتحلل المائي. لذلك ، يجب التعامل مع كميات أكبر من السلفو SMCC غير المذاب بسرعة أو استخدام 2 مجم متوفرة.
    1. تمييع αDEC-205 في PBS بحيث يتم احتواء 2.5 مجم في 900 ميكرولتر.
    2. امزج 2.5 مجم من αDEC-205 (حجم 900 ميكرولتر ؛ تم الحصول عليه من الخطوة 3.2.1) و 100 ميكرولتر من السلفو-SMCC (تم الحصول عليه من الخطوة 3.2.) في أنبوب 1.5 مل ، مما ينتج عنه حجم إجمالي قدره 1 مل.
    3. احتضان محلول αDEC-205 / sulfo-SMCC لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 550 دورة في الدقيقة في كتلة تسخين.
  3. بعد هذه الحضانات ، تتم إزالة السلفو SMCC الزائد و TCEP-HCl على الفور من المحاليل باستخدام أعمدة تحلية المياه (MWCO 7 kDa ؛ حجم عمود 5 مل).
    1. قم بلف الإغلاق السفلي للأعمدة (MWCO 7 kDa) ، وفك الغطاء ، وضع العمود في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    2. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 1,000 × جم في درجة حرارة الغرفة لإزالة السائل.
    3. ضع العمود في أنبوب جديد وقم بإزالة الغطاء. قم بتحميل الجسم المضاد / sulfo-SMCC و OVA / TCEP-HCl ببطء ، على التوالي ، إلى مركز طبقة الراتنج المدمجة لعمود واحد لكل منهما.
    4. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 1,000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
    5. تجاهل الأعمدة بعد الاستخدام. المحاليل التي تحتوي على أجسام مضادة و OVA معدة للاقتران موجودة في الأنابيب.
    6. امزج كلا المحاللين على الفور عن طريق سحب العينة لاقتران αDEC-205 و OVA.
    7. احتضان خليط αDEC-205 و OVA الناتج طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. بعد الاقتران ، تتم إزالة OVA الزائد غير المرتبط من المحلول ويتم تركيز αDEC-205 / OVA المقترن باستخدام مكثف بروتين الطرد المركزي (MWCO 150 kDa).
    1. اشطف مكثف بروتين الطرد المركزي مسبقا (MWCO 150 كيلو دالتون) عن طريق سحب 12 مل من PBS على العمود والطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 2,000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظه: إذا لزم الأمر ، كرر خطوة الطرد المركزي (3.4.1.) حتى يمر حجم حوالي 5 مل عبر العمود.
    2. قبل تحميل αDEC-205 / OVA على مكثف بروتين الطرد المركزي ، احفظ عينة 20 ميكرولتر من αDEC-205 / OVA غير المركز لتحليل اللطخة الغربية. قم بتخزين هذا الاقتباس في 4 درجات مئوية حتى التحليل.
    3. قم بتحميل αDEC-205 / OVA على مكثف بروتين الطرد المركزي عن طريق سحب العينات.
      ملاحظه: تجنب أي ملامسة لسرير الغرفة العلوية لمكثف الطرد المركزي.
    4. املأ المكثف حتى 15 مل ب PBS وقم بجهاز الطرد المركزي للمكثف لمدة 5 دقائق عند 2,000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
    5. احفظ عينة من التدفق (التدفق من خلال I) لتحليل اللطخة الغربية وتجاهل التدفق المتبقي.
    6. املأ المكثف حتى 10 مل ب PBS وقم بجهاز الطرد المركزي للمكثف لمدة 8 دقائق على الأقل عند 2,000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
    7. احفظ عينة للتدفق الثاني (التدفق من خلال II) لتحليل اللطخة الغربية وتجاهل التدفق المتبقي.
    8. بمجرد تحقيق التخصيب المطلوب (يجب ترك حوالي 1.5 مل من محلول αDEC-205 / OVA في الغرفة العلوية) ، قم بشفط العينة المركزة برفق.
      ملاحظه: إذا ترك الكثير من السوائل في الغرفة العلوية ، فيمكن تكرار الطرد المركزي ولكن يجب أن يظل قصيرا قدر الإمكان.
  5. حدد تركيز البروتين ل αDEC-205 / OVA الناتج باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير. استخدم PBS كفارغ.
  6. قم بتصفية αDEC-205 / OVA باستخدام وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظه: للتحليل اللاحق والتجارب في الجسم الحي ، يمكن تخزين αDEC-205 / OVA عند 4 درجات مئوية أو -18 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >4. التحقق من الاقتران الكيميائي بواسطة ELISA

  1. قم بإجراء ELISA لمزيد من التحقق من الاقتران الكيميائي الناجح الذي ينتج عنه αDEC-205 / OVA.
  2. قم بتغطية لوحة ELISA مناسبة مكونة من 96 بئرا ب 100 ميكرولتر / بئر من 3 نانوغرام / ميكرولتر من الجسم المضاد للأرانب αOVA في مخزن مؤقت للطلاء (0.1 متر بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) ، درجة الحموضة 9.6 المخففة في H2O).
    1. احتضان الطبق طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  3. بعد الطلاء ، اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام PBS ، على سبيل المثال ، باستخدام غسالة ELISA.
  4. قم بسد اللوحة عن طريق سحب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (10٪ FCS في PBS) في كل بئر من اللوحة واحتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بالتخفيف المتسلسل αDEC-205 / OVA (تم الحصول عليه من الخطوة 3.6.) 1: 2 في المخزن المؤقت المانع (10٪ FCS في PBS) للحصول على تخفيفات تتراوح من 6 ميكروغرام / مل إلى 93.8 نانوغرام / مل αDEC-205 / OVA وإضافة 100 ميكرولتر / بئر من هذه الكميات المتناقصة من αDEC-205 / OVA إلى الآبار.
    1. احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام PBS ، على سبيل المثال ، باستخدام غسالة ELISA.
  7. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد αrat-IgG + IgM (H + L) -HRPO (مخفف إلى 1: 2,000 في المخزن المؤقت المانع (10٪ FCS في PBS)) إلى كل بئر من اللوحة.
    1. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  8. اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام PBS ، على سبيل المثال باستخدام غسالة ELISA.
  9. أضف 50 ميكرولتر من ركيزة HRPO إلى الآبار. عند ملاحظة تفاعل لوني واضح ، أوقف التفاعل من خلال إضافة محلول إيقاف 150 ميكرولتر (1M H2SO4) لكل بئر.
  10. بعد 5 دقائق ، اقرأ الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ ELISA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المخزن المؤقت للحجب (ELISA) 10٪ FBS في PBS قارورة زراعة الخلية T25 غرينر بيو ون 690175 نحن نستخدم قوارير ثقافة الخلية القياسية لغطاء مرشح CELLSTAR ؛ بدلا من ذلك استخدم قارورة ثقافة التعليق (690195) قارورة زراعة الخلية T75 غرينر بيو ون 658175 نستخدم قوارير ثقافة خلية غطاء مرشح CELLSTAR القياسية ؛ بدلا من ذلك استخدم قارورة ثقافة التعليق (658195) قارورة زراعة الخلية T175 غرينر بيو ون 661175 نستخدم قوارير ثقافة خلية غطاء مرشح CELLSTAR القياسية ؛ بدلا من ذلك استخدم قارورة ثقافة التعليق (661195) مكثف الطرد المركزي MWCO 10 كيلو دالتون سارتوريوس في 2001 Vivaspin 20 مكثف الطرد المركزي مكثف بروتين الطرد المركزي MWCO 100 كيلو دالتون ، 5-20 مل ثيرمو فيشر العلمي 88532 مكثف بروتين بيرس ، PES 5-20 مل ؛ نستخدم مكثف بيرس 150 كيلو MWCO 20 مل (رقم الكتالوج 89921) ، والذي لم يعد متاحا زجاجات الطرد المركزي نالجين 525-2314 PPCO (بولي بروبيلين كوبوليمر) مع إغلاق لولبي PP (بولي بروبلين) ، 500 مل ؛ تم الحصول عليها من VWR ، ألمانيا عازلة الطلاء (ELISA) 0.1 م بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) في H2O (الرقم الهيدروجيني 9.6) تحلية الأعمدة MWCO 7 كيلو دالتون ثيرمو فيشر العلمي 89891 أعمدة تحلية زيبا تدور من Thermo Scientific ، 7K MWCO ، 5 مل كاشف الكشف ELISA (ركيزة HRPO) سيجما ألدريتش / ميرك T8665-100 مل 3،3 ′ ، 5،5 ′ - نظام الركيزة السائلة Tetramethylbenzidine (TMB) لوحة ELISA 96 بئر ثيرمو فيشر العلمي 442404 MaxiSorp Nunc-Immuno Plate مصل ربلة الساق الجنينية بان بيوتك ص 40-47500 FBS موطن جيد ISF-1 متوسط Biochrom / bioswisstec ف 9061-01 الورم الهجين NLDC-145 ATCC إتش بي -290 إذا لم تكن في متناول اليد بالفعل ، فيمكن الحصول على خلايا الورم الهجين من ATCC البيضالومين Hyglos (عبر BioVendor) 321000 EndoGrade OVA فائق النقاء مع <0.1 EU/mg البنسلين / الستربتومايسين ثيرمو فيشر العلمي 15140122 يمكن استخدام Gibco Penicillin / Streptomycin 10.000 U / ml ؛ بدلا من ذلك يمكن استخدام Gibco Penicillin / Streptomycin 5.000 U / ml (15070-063) زجاجات أسطوانية لثقافة خلايا البولي إيثيلين تيريفثاليت جلايكول PETG Nunc في المختبر 734-2394 قياسي مطلي ب PDL ، مغطى بفتحات تهوية (1.2X) ، 1050 سم مربع ، حجم 100 - 500 مل ؛ تم الحصول عليه من VWR ، ألمانيا شرائط مؤشر الأس الهيدروجيني ميرك 109535 شرائط مؤشر الأس الهيدروجيني 0-14 الجسم المضاد للماعز متعدد النسيلة αrat-IgG + IgM-HRPO (ELISA) جاكسون للأبحاث المناعية 112-035-068 تم الحصول عليها من Dianova ، ألمانيا ؛ استخدمت في 1: 2000 ل ELISA أرنب متعدد النسيلة αOVA (ELISA) أبكام أب181688 تستخدم في 3 نانوغرام / ميكرولتر بروتين G عمود السيفاروز ميرك / ميليبور ص 3296 5 مل من البروتين G Sepharose ، Fast Flow معبأة في عمود فارغ PD-10 (Merck ، GE 17-0435-01) قابس مطاطي أومنليلاب 5230217 سدادات مطاطية من DEUTSCH & NEUMANN (Φ السفلي 17 مم ؛ Φ العلوي 22 مم) أنبوب سيليكون أومنليلاب 5430925 DEUTSCH & NEUMANN (داخل Φ 1 مم ؛ خارجي Φ 3 مم) نحيف سريع لقد استخدمنا شوكولاتة سليمة سريعة عادية متوفرة مجانا في الصيدلية كما هو الحال في نهج اللطخة الغربية هذا ، فقد أسفرت عن نتائج أفضل من مسحوق الحليب حل التوقف (ELISA) 1 م H2SO4 سلفو SMCC ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 22322 بيرس سولفو-SMCC Cross-Linker ؛ بدلا من ذلك استخدم رقم الكتالوج A39268 (10 × 2 مجم) وحدة فلتر الحقنة 0.22 ميكرومتر ميرك / ميليبور SLGV033RS وحدة فلتر حقنة Millex-GV ، 0.22 ميكرومتر ، PVDF ، 33 مم ، معقمة جاما حقنة 10 مل أومنليلاب محاقن يمكن التخلص منها Injekt® Solo B.Braun قنيات الستريكانية® ب. براون Sterican® G 20 × 1 1/2 ""؛ 0.90 × 40 مم ؛ أصفر TCEP-حمض الهيدروكلوريك ثيرمو فيشر العلمي أ35349 موصل الأنابيب أومنليلاب موصلات أنابيب مصغرة من كلاينفيلد لأنبوب السيليكون

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DEC 205

مقالات ذات صلة