فحص المذنب للكشف عن تلف الحمض النووي في الخلايا

الملخص

المصدر: Ji, Y., et al. نهج فحص المذنب عالي الإنتاجية لتقييم تلف الحمض النووي الخلوي. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح الفيديو اختبار المذنب للكشف عن تلف الحمض النووي بعد التعرض لعوامل ضارة. في ظل الظروف القلوية ، ينفك الحمض النووي ويشوه ، وعند الرحلان الكهربائي ، يهاجر الحمض النووي غير التالف والتالف بشكل مختلف في هلام الاغاروز ، مكونا بنية على شكل مذنب. يشكل الحمض النووي غير التالف المهاجر ببطء رأس المذنب الدائري ، بينما تشكل شظايا الحمض النووي التالفة المهاجرة بسرعة ذيل المذنب الممدود.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد لمقايسة المذنب

1. تحضير شرائح المجهر
   1. صب 1٪ (وزن / حجم) من الاغاروز العادية لدرجة الانصهار [المذاب في الماء المقطر المزدوج (ddH₂O)] في أنبوب سعة 50 مل والميكروويف لإذابة الاغاروز في ddH₂O. يخزن في 37 درجة مئوية لمنع التصلب قبل شرائح الطلاء. في حالة حدوث تصلب ، تخلص منه وحضره طازجا.
   2. ينزلق المجهر قبل الطلاء عن طريق غمس الشرائح في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 1٪ (وزن / حجم) من نقطة الانصهار العادية.
   3. امسح الجزء الخلفي من الشرائح بسرعة بعد غمس الشرائح.
      ملاحظه: سيؤدي عدم مسح الجزء الخلفي من الشرائح بشكل صحيح إلى زيادة ضوضاء خلفية الشرائح أثناء خطوة التحليل بالمجهر.
   4. قم بتسمية الشريحة المطلية بعلامة دائمة في الزاوية اليمنى السفلية من القسم المصنفر (الشكل 1 أ). يوضح هذا أي جانب من الشريحة مغلف مسبقا.
   5. اترك الاغاروز يتماسك ويجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
   6. لف الشرائح المجففة في المناديل الورقية واحفظها في صندوق.

< p class = "jove_title" >2. تحضير العينات

1. الخلايا المستنبتة
   ملاحظه: أولا ، عالج الخلايا بالعامل (العوامل) الضارة قبل بدء فحص المذنب. ثم قم بما يلي.
   1. إذا كانت الخلايا ملتصقة ، فقم بالتربسين بالخلايا لتحريرها من قارورة زراعة الخلايا أو أطباق بتري لزراعة الخلايا ، عند التقاء الخلايا المناسب. قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة وسائط تحتوي على المصل.
   2. انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 50 مل ، جهاز طرد مركزي (على سبيل المثال ، بالنسبة ل HaCaTs ، جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة) ، قم بإزالة المادة الطافية برفق ، وأضف 1 مل من PBS إلى حبيبات الخلية.
   3. إجراء عد الخلايا.
   4. انقل 30,000 خلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 7,607 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   5. قم بإزالة المادة الطافية برفق وقم بتخزين حبيبات الخلية على الجليد في الظلام قبل إجراء فحص المذنب.
      ملاحظه: يجب اختبار الخلايا بانتظام بحثا عن تلوث الميكوبلازما قبل إجراء فحص المذنب لمنع ، من بين تأثيرات أخرى ، تكوين تلف الحمض النووي الاصطناعي واستجابة تلف الحمض النووي المتغيرة ، كما ورد. يمكن تغيير ظروف الطرد المركزي ، حسب الحاجة ، اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة.
2. تحضير الخلايا المستنبتة لفحص الإصلاح
   1. خلايا الثقافة في قارورة زراعة الخلية أو أطباق بتري.
   2. اغسل الخلايا ب 1 مل من PBS مرتين قبل معالجة الخلايا بعوامل ضارة (على سبيل المثال ، بالنسبة لخلايا BE-M17 ، عالجها ب 50 ميكرومتر من H₂O₂ لمدة 20 دقيقة) على الجليد لمنع حدوث الإصلاح أثناء العلاج.
   3. اغسل الخلايا برفق باستخدام 1 مل من PBS مرتين لإزالة أي عوامل ضارة متبقية.
   4. أعد إدخال وسط زراعة الخلايا واسمح للخلايا بالإصلاح لفترات متفاوتة (على سبيل المثال ، 0 دقيقة ، 30 دقيقة ، 2 ساعة ، 6 ساعات ، 24 ساعة ، و 30 ساعة) في حاضنة رطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}).
   5. في كل نقطة زمنية ، اجمع 30,000 خلية في وسط زراعة الخلايا المحتوي على ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) بنسبة 10٪ وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
   6. قبل إجراء فحص المذنب ، قم بإذابة الخلايا بسرعة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي وقم بطردها عند 7،607 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   7. قم بإزالة المادة الطافية وتخزين حبيبات الخلية على الجليد قبل إجراء الفحص (أي من الخطوة 3).

< p class = "jove_title" >3. تحلل الخلية

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الإجراءات على الجليد.

1. استخدم 12,000 خلية أو 2.5 ميكرولتر من الدم الكامل لكل هلام.
2. قم بإعداد 0.6٪ (وزن / حجم) من الاغاروز المنخفض نقطة الانصهار المذاب في PBS باستخدام الميكروويف ، وضعه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمنعه من التصلب.
3. قم بتسمية الطرف المتجمد للشرائح المطلية مسبقا باسم المحقق وتاريخه ومعلومات العلاج باستخدام قلم تحديد أو قلم رصاص دائم.
4. ضع لوحا تقشعر له الأبدان على مقعد مسطح وأدخل عبوتي التبريد المجمدة في الدرج المنزلق أسفل السطح المعدني (كما هو موضح في الشكل 2).
5. ضع الشرائح على لوح التبريد واترك الشرائح تبرد مسبقا لمدة 1-2 دقيقة قبل إضافة 0.6٪ (وزن / حجم) منخفضة نقطة الانصهار التي تحتوي على خلايا تحتوي على الاغاروز.
   ملاحظه: قد يؤدي ترك الشرائح على لوح التبريد لأكثر من 1-2 دقيقة إلى تكوين تكاثف على سطح الشريحة بسبب الرطوبة المحيطة. هذا قد يجعل المواد الهلامية ذات نقطة الانصهار المنخفضة أقل استقرارا على الشرائح.
6. تفريق الحبيبات (الخطوة 2.2.7) عن طريق الدوامة. تأكد من إزالة كل المادة الطافية من الحبيبات. ضع أنابيب العينة (التي تحتوي على الخلايا المحببة) على الفور مرة أخرى على الجليد.
   ملاحظه: عند وضع الأنابيب المحتوية على العينة في جهاز الطرد المركزي ، ضعها مع توجيه المفصلة للخارج بحيث يتم جمع الحبيبات على هذا الجانب من الأنبوب. في بعض الأحيان يكون من الصعب رؤية الحبيبات ، ومن السهل إزاحتها أثناء إزالة المادة الطافية. سيمكن الطرد المركزي بغطاء الأنبوب في هذا الاتجاه المرء من معرفة مكان وجود حبيبات الخلية.
7. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 200 ميكرولتر من 0.6٪ من الاغاروز نقطة انصهار منخفضة (LMP agarose) واخلطها عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل دون تكوين فقاعات. بعد ذلك ، انقل بسرعة 80 ميكرولتر من الخلايا المحتوية على LMP agarose إلى شريحة مبردة وقم بوضع غطاء على الجل بسرعة.
8. اترك الجل يتماسك على طبق التبريد لمدة 1-2 دقيقة.
9. في هذه الأثناء ، قم بإعداد محلول عمل سعة 500 مل من محلول التحلل المؤقت (الجدول 1) واسكبه في طبق التحلل (الشكل 3).
10. بمجرد ضبط المواد الهلامية ، قم بإزالة الغطاء بسرعة عن طريق إمساك الشريحة برفق بين الإبهام والسبابة وتحريك الغطاء من الجل.
11. ضع الشرائح التي تحتوي على عينات داخل حامل الشريحة (يجب أن تكون جميع علامات "النقاط" السوداء على الشرائح متجهة في نفس الاتجاه عند وضعها في الموجة الحاملة) (الشكل 1 ب) ، ثم ضع حامل الشريحة داخل طبق التحلل (الشكل 3).
12. أغلق غطاء طبق التحلل واحتفظ بطبق التحلل في الثلاجة طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، أيهما يناسب الجدول الزمني للمشغل.

< p class = "jove_title" >4. الرحلان الكهربائي

1. قم بإزالة حامل الشريحة بعناية من طبق التحلل. احرص على عدم إزعاج المواد الهلامية.
2. ضع حامل الشرائح برفق في طبق غسيل محمل مسبقا ب ddH₂O المثلج واتركه لمدة 30 دقيقة مع التأكد من تغطية الشرائح بالكامل ب ddH₂O.
3. أدخل حزمة تبريد مجمدة داخل الدرج المنزلق أسفل خزان الرحلان الكهربائي للحفاظ على درجة الحرارة العازلة المثلى.
4. أضف بعناية محلول عمل الرحلان الكهربائي المثلج (الجدول 1) إلى خزان الرحلان الكهربائي وانقل الناقل المنزلق إلى خزان الرحلان الكهربائي. قم بتوجيه الشرائح بحيث تشير أجزائها الشفافة مع المواد الهلامية المحتوية على الخلية (أي وليس النهايات المتجمدة/الملصقة) نحو الكاثود (القطب الأحمر).
5. اسمح للشرائح بالجلوس في خزان الرحلان الكهربائي لمدة 20 دقيقة حتى يرتاح الحمض النووي ويسترخي. احتفظ بمصدر الطاقة مغلقا أثناء هذه الخطوة.
6. إذا لزم الأمر ، أدخل حزمة تبريد مجمدة جديدة لزيادة التبريد إلى أقصى حد.
7. قم بإجراء الرحلان الكهربائي لمدة 20 دقيقة عند 1.19 فولت / سم ، أو أي ظروف تم تحسينها.
   ملاحظه: يوصى بتحسين ظروف تشغيل الرحلان الكهربائي وحجم المخزن المؤقت لكل مختبر. لا يتسبب استخدام حامل شريحة واحد فقط أثناء الرحلان الكهربائي في أي تأثير للشرائح على مقاومة المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي ، ولم ير المؤلفون تأثيرا كبيرا في الجهد أو التيار عندما تغير عدد الشرائح.
8. قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة ، وقم بإزالة الناقل المنزلق بعناية من خزان الرحلان الكهربائي ، واتركه يستنزف على المناديل الورقية لمدة 30 ثانية.
9. ضع حامل الشريحة في الطبق الذي يحتوي على مخزن مؤقت للتحييد (الجدول 1). اتركه لمدة 20 دقيقة.
10. قم بإزالة حامل الشريحة من طبق التحييد ، وضعه في طبق الغسيل الذي يحتوي على ddH2O المثلج ، واتركه لمدة 20 دقيقة.
11. قم بإزالة حامل الانزلاق من الماء واترك الشرائح تجف في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، أو في درجة حرارة الغرفة طوال الليل ، أو لا تجف ، حسب جدول المشغل.
    ملاحظه: إذا لم يكن هناك تجفيف في الخطوة 4.11 ، فقم بتنفيذ خطوة التلوين من 5.2.

< p class = "jove_title" >5. تلطيخ يوديد البروبيديوم (PI)

1. انقل حامل الشرائح إلى طبق غسيل يحتوي على ddH₂O المثلج لإعادة ترطيب الشرائح واتركها لمدة 30 دقيقة.
2. ضع حامل الشريحة في طبق تلطيخ يحتوي على 2.5 ميكروغرام / مل من محلول يوديد البروبيديوم.
   ملاحظه: يوديد البروبيديوم حساس للضوء ، لذا تعامل معه في منطقة مظلمة. كما أنها سامة.
3. أغلق غطاء طبق التلوين واحتضنه لمدة 20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
4. انقل حامل الشرائح إلى طبق منفصل ، واغسله ب ddH₂O المثلج لمدة 20 دقيقة.
5. قم بإزالة حامل الشرائح من الطبق وجففه تماما في الظلام ، إما في حاضنة 37 درجة مئوية أو في درجة حرارة الغرفة ، اعتمادا على جدول المشغل أو تفضيلاته.
6. بمجرد تجفيف الشرائح تماما ، قم بإزالتها من حامل الشرائح وقم بتخزينها في صندوق شرائح في الظلام حتى تصبح جاهزة لتحليل الصورة.
   ملاحظه: ستظل الشرائح قابلة للقراءة إلى أجل غير مسمى ويمكن إعادة تلطيخها إذا لزم الأمر.

6. تسجيل المذنب وتحليل البيانات

ملاحظة: مصطلح "مذنب" مشتق من صور الخلايا التالفة عند عرضها تحت المجهر بعد إجراء الفحص (الشكل 4). في ظل ظروف الرحلان الكهربائي ، لا يهاجر الحمض النووي في الخلايا غير التالفة إلى حد كبير ولكنه يبقى في كروي يسمى "رأس" المذنب. ومع ذلك ، فإن وجود فواصل الخيوط يسمح للحمض النووي للخلية بالهجرة خارج الرأس وتشكيل "ذيل" ، مما يؤدي إلى ظهور مثل المذنب (الشكل 4). كلما زاد الحمض النووي في الذيل ، زاد الضرر.

1. قم بتشغيل المجهر الفلوري باستخدام مرشح PI (أحمر) (λ = 536/617 نانومتر) وبرنامج تسجيل مقايسة المذنب.
2. أضف قطرة ماء باستخدام ماصة باستور إلى الجل وقم بتغطيتها بغطاء غطاء.
3. ضع الشرائح في المجهر الفلوري و "سجل" المذنبات.
   ملاحظه: التسجيل هو وسيلة يتم من خلالها تقييم المذنبات ، لتحديد مقدار الضرر الموجود في كل مذنب. على نطاق واسع ، يمكن تحقيق ذلك باستخدام نهجين ، وفقا لتفضيل المستخدم الذي يختاره ، إما بالعين (قياس حجم المذنبات على مقياس من صفر إلى أربعة) أو باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا بحرية أو تجارية30. بشكل عام ، يقوم كلا النهجين بتقييم حجم ذيل المذنب ، على الرغم من أنه يمكن تحديد مجموعة متنوعة من نقاط النهاية المتعلقة بالمذنبات. إذا كنت تستخدم البرنامج ، فانقر فوق منتصف رأس المذنب وانتظر حتى يكتشف البرنامج المذنب تلقائيا ، ثم يقيم نقطة النهاية المختارة (الشكل 4).
4. سجل 50 مذنبا لكل هلام و 100 مذنب لكل عينة (أي كل عينة تتوافق مع علاجات مختلفة لإتلاف الحمض النووي ، أو تكرارها).
تكرار
5. التجارب (ن = 2) أو تكرار التجارب ثلاث مرات (ن = 3).
   ملاحظه: إذا تم إجراء تجارب n = 2 فقط ، فلا يمكن إجراء التحليل الإحصائي ، ولكن إذا كان n = 3 ، فقم بإجراء اختبار D'agostino الطبيعي لا تجتاز معظم بيانات فحص المذنبات اختبار الحياة الطبيعية. في هذه الحالة ، استخدم اختبارا غير معلمي (اختبار Kruskal-Wallis مع اختبار Dunn للمقارنات المتعددة ، واختبارات Mann-Whitney المحددة في p < 0.05).

الكاشف حل المخزون حل العمل عازلة التحلل 100 ملي مولار Na₂EDTA و 2.5 M كلوريد الصوديوم و 10 ملي مولار قاعدة تريس في ddH₂O ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10 مع 10 M هيدروكسيد الصوديوم 1٪ Triton X-100 في محلول مخزون التحلل عازلة الرحلان الكهربائي 10 م هيدروكسيد الصوديوم و 200 ملي Na₂EDTA في ddH₂O 300 ملي هيدروكسيد الصوديوم و 1 ملي Na₂EDTA ؛ الرقم الهيدروجيني > 13 المخزن المؤقت للتحييد 0.4 م Tris Base في ddH₂O ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك تلطيخ المخزن المؤقت 1 مجم / مل يوديد بروبيديوم 2.5 ميكروغرام/مل يوديد بروبيديوم في DDH₂O

الجدول 1: تكوين الكواشف المستخدمة في مقايسة المذنب القلوي عالي الإنتاجية (HTP ACA). يتم عرض المخزون وتركيزات العمل من التحلل ، والرحلان الكهربائي ، والتحييد ، والمخازن المؤقتة للتلطيخ.

النتائج

الشكل 1: صور تمثيلية لشريحة فحص مذنب ورف HTP (حامل منزلق مجهري). (أ) للاتجاه الصحيح ، يتم التعرف على الوجه المطلي مسبقا لشريحة المجهر بنقطة سوداء في الزاوية اليمنى من شريحة المجهر. (ب) توضح صورة حامل HTP كيفية الاحتفاظ بالشرائح في اتجاه رأسي ضيق ، مع وجود علامات تبويب على الموجة الحاملة لإصلاح اتجاهه داخل خزان الرحلان الكهربائي. يمكن لكل حامل استيعاب ما يصل إلى 25 شريحة.

< p class = "jove_cont...

المواد