فحص المذنب للكشف عن تلف الحمض النووي في الخلايا

الملخص

المصدر: Ji, Y., et al. نهج فحص المذنب عالي الإنتاجية لتقييم تلف الحمض النووي الخلوي. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح الفيديو اختبار المذنب للكشف عن تلف الحمض النووي بعد التعرض لعوامل ضارة. في ظل الظروف القلوية ، ينفك الحمض النووي ويشوه ، وعند الرحلان الكهربائي ، يهاجر الحمض النووي غير التالف والتالف بشكل مختلف في هلام الاغاروز ، مكونا بنية على شكل مذنب. يشكل الحمض النووي غير التالف المهاجر ببطء رأس المذنب الدائري ، بينما تشكل شظايا الحمض النووي التالفة المهاجرة بسرعة ذيل المذنب الممدود.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد لمقايسة المذنب

1. تحضير شرائح المجهر
   1. صب 1٪ (وزن / حجم) من الاغاروز العادية لدرجة الانصهار [المذاب في الماء المقطر المزدوج (ddH₂O)] في أنبوب سعة 50 مل والميكروويف لإذابة الاغاروز في ddH₂O. يخزن في 37 درجة مئوية لمنع التصلب قبل شرائح الطلاء. في حالة حدوث تصلب ، تخلص منه وحضره طازجا.
   2. ينزلق المجهر قبل الطلاء عن طريق غمس الشرائح في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 1٪ (وزن / حجم) من نقطة الانصهار العادية.
   3. امسح الجزء الخلفي من الشرائح بسرعة بعد غمس الشرائح.
      ملاحظه: سيؤدي عدم مسح الجزء الخلفي من الشرائح بشكل صحيح إلى زيادة ضوضاء خلفية الشرائح أثناء خطوة التحليل بالمجهر.
   ....

النتائج

الشكل 1: صور تمثيلية لشريحة فحص مذنب ورف HTP (حامل منزلق مجهري). (أ) للاتجاه الصحيح ، يتم التعرف على الوجه المطلي مسبقا لشريحة المجهر بنقطة سوداء في الزاوية اليمنى من شريحة المجهر. (ب) توضح صورة حامل HTP كيفية الاحتفاظ بالشرائح في اتجاه رأسي ضيق ، مع وجود علامات تبويب على الموجة الحاملة لإصلاح اتجاهه داخل خزان الرحلان الكهربائي. يمكن لكل حامل استيعاب ما يصل إلى 25 شريحة.

< p class = "jove_cont.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أغطية زجاجية مقاس 22 × 22 مم فيشر ساينتفيك ، هامبتون ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة الأمريكية 631-0124 مجهر مضان مجهز
مع الكاميرا زايس ، جينا ، ألمانيا نظام فحص المذنب HTP ساطور علمي كومباك - 50 الخلايا الكيراتينية البشرية (HaCaTs) مجموعة الثقافة من النوع الأمريكي
(ATCC) ، ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية توقف يمكن شراؤها من
أخرى الشركة
أديكسبيو تكنولوجيز
القط # T0020001 بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)
30٪ في الماء فيشر ساينتفيك ، هامبتون ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة الأمريكية ص2633-500 برنامج تحليل الصور والبيانات أداة إدراكية ،
بوري سانت إدموندز ، إنجلترا ،
المملكة المتحدة 125525 برنامج تحليل الصور المجاني هو
متاح على سبيل المثال ، ImageJ نقطة انصهار منخفضة Agarose Invitrogen
والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية ص 4864 Na2 EDTA (ثنائي الصوديوم
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك) سيجما ألدريتش ،
سانت لويس ، ميزوري ،
الولايات المتحدة الأمريكية E5134 كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) سيجما ألدريتش ،
سانت لويس ، ميزوري ،
الولايات المتحدة الأمريكية إس 7653 Nanopure Infinity Ultra Pure Water
النظام (Barnstead Nanopure) حراري علمي ،
والثام ، ماساتشوستس ،
الولايات المتحدة الأمريكية د11901 ماء فائق النقاء (16 MΩ سم ^ {-1} ) هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) سيجما ألدريتش ،
سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية E5134 نقطة الانصهار العادية Agarose فيشر العلمي ،
هامبتون ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة الأمريكية 16520100 لشرائح الطلاء المسبق بروبيديوم اليود
(1.0 مجم / مل في الماء) سيجما ألدريتش ،
سانت لويس ، ميزوري ،
الولايات المتحدة الأمريكية 12-541BP486410ML مجهر زجاجي بلوري أحادي
الشرائح فيشر العلمي ،
هامبتون ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة الأمريكية 12-541 ب صندوق الشريحة فيشر العلمي ،
هامبتون ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة الأمريكية 03-448-2 مقاوم للضوء ، لحماية الخلايا من
الضرر العرضي للتشكيل
(وفقا للرأي السائد على نطاق واسع)
ومنع تلاشي الفلورسنت
صبغ لوحة تقشعر لها الأبدان منزلقة الساطور العلمي ،
الرجبي ، إنجلترا ،
المملكة المتحدة CSL-CHILLPLATE طبق العلاج الساطور العلمي ،
الرجبي ، إنجلترا ،
المملكة المتحدة STAINDISH4X قاعدة تريس سيجما ألدريتش ،
سانت لويس ، ميزوري ،
الولايات المتحدة الأمريكية 93362 تريتون X-100 فيشر العلمي ،
هامبتون ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة الأمريكية بي بي 151-500 التربسين EDTA (0.5٪) Invitrogen
جيبكو ،
والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 15400054 الناقل الشريحة العمودي الساطور العلمي ،
الرجبي ، إنجلترا ،
المملكة المتحدة كومباك -25