فحص امتصاص الأحماض الأمينية ذات العلامات المشعة لتحديد الامتصاص الخلوي للأحماض الأمينية

الملخص

المصدر: Shen، L.، et al. تقييم استهلاك الأحماض الأمينية في خلايا العظام المستنبتة وأعمدة العظام المعزولة. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو تقنية في المختبر لتقدير امتصاص الأحماض الأمينية بواسطة الخلايا اللحمية المشتقة من نخاع العظام. تتوسط ناقلات الأحماض الأمينية المعتمدة على Na ⁺ في امتصاص الأحماض الأمينية ذات العلامات الإشعاعية داخل الخلايا ، ويتم تقدير الامتصاص الخلوي عن طريق قياس النشاط الإشعاعي.

البروتوكول

يتطلب استخدام المواد المشعة (RAM) موافقة مسبقة من لجنة السلامة المعينة في كل مؤسسة.

فئة < ص = "jove_title" >1. امتصاص الأحماض الأمينية في الخلايا

1. لوحة 5 × 10⁴ خلايا ST2 في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئر. خلايا صفيحية في α-MEM تحتوي على 10٪ FBS و 100 وحدة / مل بنسلين و 0.1 ميكروغرام / مل ستربتومايسين (Pen / Strepe). قم بوضع آبار إضافية من الخلايا لتحديد عدد الخلية لكل شرط للتطبيع في الخطوة 1.12. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. استزراع الخلايا لمدة 2-3 أيام حتى التقاء.
3. في يوم التجربة ، قم بإعداد المحاليل التالية: 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 و Krebs Ringers HEPES (KRH) ، درجة الحموضة 8.0: (120 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد كلوريد ، 2 ملي كلوريد_{المليوم 2} ، 1 ملي ملي كلوريد_{المغنيد 2} ، NaHCO₃ ، 5 ملي هيبس ، 1 ملي مولار د-جلوكوز). التدفئة إلى 37 درجة مئوية.
4. شفط الوسط واغسل الخلايا مرتين ب 1 مل من 1x PBS ، درجة الحموضة 7.4.
   ملاحظه: هذا البروتوكول مناسب أيضا للخلايا غير المتقاربة سريعة الانقسام. في هذه الحالة ، من المهم تطبيع النشاط الإشعاعي إما إلى عدد الخلية المطلق أو محتوى الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك ، ضع في اعتبارك زيادة حجم لوحة المزرعة أو القارورة لزيادة العدد الكلي للخلية وقيم النسخة لكل ألف دقيقة. هذا مهم لتحديد تجريبيا على أساس فردي.
5. استنشق 1x PBS واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 مل KRH.
6. اصنع 4 ميكروCi / مل L- [3،^4-3H] - وسائط عمل الجلوتامين عن طريق تخفيف 4 ميكرولتر من [1 μCi ^μL-1] L- [3،4-3 H] - مخزون الجلوتامين لكل 1 مل من KRH.
   ملاحظه: قبل استخدام المواد المشعة، يرجى الاتصال بمكتب السلامة الإشعاعية في مؤسستك للحصول على الموافقات. يجب تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالإشعاع خلف درع زجاج شبكي.
7. احتضان الخلايا التي تحتوي على 0.5 مل من KRH تحتوي على 4 ميكرو Ci / مل L- [3،^4-3H] - وسائط عمل الجلوتامين لمدة 5 دقائق.
8. اجمع الوسط المشع وقم بتوزيعه في حاوية النفايات السائلة. اغسل الخلايا ثلاث مرات لفترة وجيزة باستخدام KRH المثلج لإنهاء التفاعل. اجمع وتخلص من جميع الغسالات الموجودة في حاوية النفايات السائلة المشعة.
9. أضف 1 مل من 1٪ SDS إلى كل بئر وقم بترتيتوري 10x لتحلل الخلايا وتجانسها. انقل محللات الخلية إلى أنابيب سعة 1.5 مل. تخلص من ألواح زراعة الخلايا والماصات المصلية وأطراف الماصة في حاوية النفايات المشعة الصلبة.
10. جهاز طرد مركزي عند >10,000 × جم لمدة 10 دقائق. انقل المواد الطافية إلى قوارير تلألؤ تحتوي على 8 مل من محلول التلألؤ. تخلط عن طريق رج قوارير التلألؤ بقوة. تخلص من الأنابيب وأطراف الماصات في حاوية النفايات المشعة الصلبة.
11. اقرأ النشاط الإشعاعي بالعدد في الدقيقة (cpm) باستخدام عداد التلألؤ. تخلص من قوارير التلألؤ في حاوية نفايات قارورة التلألؤ.
قم
12. بإعادة التربسين وإعادة تعليق وعد الخلايا من الصفائح غير المشعة المتبقية للخلايا (انظر الخطوة 1.1) لتقدير عدد الخلايا في الثقافات المشعة المحللة. باستخدام مقياس كثافة الدم ، احسب عدد الخلايا لكل بئر غير مشع لكل حالة تجريبية. تطبيع النسخة الإجمالية لكل مليون من الخطوة 1.11 إلى رقم الخلية المقدر من الألواح غير المشعة.
13. بعد الانتهاء من التجربة ، قم بتطهير غطاء مزرعة الخلايا والمقعد وجميع الأدوات برذاذ مزيل التلوث الإشعاعي. أخيرا ، قم بإجراء اختبارات المسح للتأكد من خلو منطقة العمل من الإشعاع.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.25٪ تربسين جيبكو 25200 طبق 12 بئر كورنينج 3513 عداد التلألؤ بيكمان LS6500 كلوريد الكالسيوم سيغما سي 1016 كلوريد الكولين سيغما سي 7077 D- (+) - محلول الجلوكوز سيغما جي 8769 DPBS جيبكو 14190 هيبس (1 م) جيبكو 15630 [م] L- [3،4-3H (N)] - الجلوتامين بيركين إلمر NET551250UC قوارير الومضادة السائلة سيغما Z190535 محلول كلوريد الليثيوم ، 8M سيغما L7026 كلوريد المغنيسيوم سيغما M8266 ميمα جيبكو هاتف 12561 أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، 15 مل بيوتيكس 89511-256 كلوريد البوتاسيوم سيغما ص 3911 بيكربونات الصوديوم سيغما إس 6014 كلوريد الصوديوم سيغما S9888 كبريتات دوديسيل الصوديوم سيغما 436143 Ultima Gold (محلول التلألؤ) بيركين إلمر 6013329 α-(ميثيل أمينو) حمض الأيزوبوتيريك سيغما M2383