الفحص اللوني للقياس الكمي للاكتات في عينات الاختبار

الملخص

المصدر: Yanase, S., et al. فحوصات لونية صغيرة الحجم للاكتات داخل الخلايا والبيروفات في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو مقايسة لونية لقياس اللاكتات في محللات الخلايا باستخدام إنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات. يحول هذا الإنزيم اللاكتات إلى بيروفات ، جنبا إلى جنب مع تحويل NAD إلى NADH الذي يتفاعل مع أصباغ التيترازوليوم ويعطي منتجا ملونا يمكن قياسه بشكل طيفي لقياس اللاكتات.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الثقافة المتزامنة ل C. ايليجانس

1. قبل البذر ، استزراع الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية) سلالة OP50 بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في 300 مل من وسط مرق Luria-Bertani السائل. قم بتخزين OP50 المستنبت عند -4 درجة مئوية.
   1. لصنع وسط سائل مرق LB ، استخدم 10 جم من التربتون ، و 5 جم من مستخلص الخميرة ، و 10 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.5 مل من 1 نيوتروكسيد الصوديوم ، وأضفه إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. الأوتوكلاف.
      ملاحظه: تتوفر سلالات OP50 و C. elegans من مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (جامعة مينيسوتا ، سانت بول ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية).
2. لعمل أجار وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) ، استخدم 3 جم من كلوريد الصوديوم ، و 2.5 جم من البيبتون ، و 17 جم من الأجار ، و 975 مل من الماء منزوع الأيونات. الأوتوكلاف. تبرد إلى 55 درجة مئوية ، ثم تضاف معقمة ، بالترتيب ، 1 مل من 1 م MgSO₄ ، 1 مل من 1 M CaCl₂ ، 1 مل من 5 مجم / مل من الكوليسترول في EtOH ، و 25 مل من 1 M فوسفات البوتاسيوم الرقم الهيدروجيني 6.0 في أطباق بتري 90 مم.
   1. للحصول على 1 M من فوسفات البوتاسيوم درجة الحموضة 6.0 ، استخدم 108.3 جم من KH₂PO₄ و 46.6 جم من K₂HPO₄ ، وأضف الماء منزوع الأيونات إلى 1 لتر. الأوتوكلاف.
3. انشر 1-2 مل من OP50 المستنبت على ألواح أجار NGM. لعمل طبقة رقيقة من OP50 ، احتضن الألواح طوال الليل في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة أي ديدان خيطية.
   ملاحظه: يمكن تخزين ألواح أجار NGM الملقحة OP50 في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أسابيع.
4. أضف ما لا يقل عن 100 دودة على صفيحة أجار NGM مع OP50 ، وزراعتها عند 20 درجة مئوية حتى مرحلة البلوغ. مطلوب ثلاث لوحات على الأقل.
5. لجمع البيض في الرحم ، انقل خنثى الحمل من صفائح أجار NGM الثلاثة لكل منها 5 مل من المخزن المؤقت S في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، واغسل الديدان 3 مرات باستخدام 15 مل من المخزن المؤقت S باستخدام الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
   1. لعمل المخزن المؤقت S ، استخدم 5.9 جم من كلوريد الصوديوم و 50 مل من 1 متر من فوسفات البوتاسيوم الرقم الهيدروجيني 6.0 ، وأضفه إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. الأوتوكلاف.
6. قم بإذابة الديدان في محلول هيبوكلوريت قلوي للتفكيك وعزل البيض السائب (0.5 مل من المبيض الطازج أو ما يعادله: 5-6٪ هيبوكلوريت الصوديوم ، 0.1 مل من 10 M هيدروكسيد الصوديوم ، حوالي 4.5 مل من المخزن المؤقت S) ، وقم بوضع المحلول لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الخلط عن طريق القلب.
   ملاحظه: في غضون 15 دقيقة ، يجب أن تذوب الديدان البالغة ، تاركة محلولا ضبابيا من البيض محررا من جثثها (يجب تأكيد البويضات المحررة باستخدام مجهر مجسيمي). بدلا من 0.1 مل من 10 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم ، يمكن أيضا استخدام 0.2 مل من 5 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم.
7. بعد معالجة هيبوكلوريت ، اغسل حبيبات البيض 3 مرات باستخدام 15 مل من المخزن المؤقت S ، وأعد تعليقها في 5-6 مل من المخزن المؤقت S. يفقس البيض الذي تم إطلاقه أثناء الحضانة الليلية عند 20 درجة مئوية في المخزن المؤقت S بدون بكتريا قولونية لزراعة متزامنة مع العمر ليرقات المرحلة L1.
8. لتحديد العدد التقريبي ليرقات المرحلة L1 ، قم بحساب الديدان باستخدام مجهر مجسمة في 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت S بعد تعليق اليرقات 3 مرات على الأقل ، وحساب المتوسط. بعد ذلك ، قم بنقل يرقات المرحلة L1 إلى خمس ألواح أجار NGM مع OP50 (1،500-3،000 دودة لكل طبق باستخدام طبق بتري 90 مم) ، وزراعتها عند 20 درجة مئوية حتى تنمو إلى مرحلة الشباب البالغين عندما يبدأ الإخصاب الذاتي ويتم وضع عدد قليل من البيض (عادة بعد 3 أيام).

< p class = "jove_title" >2. استخراج الكسر الخلوي من C. ايليجانس

1. اجمع ديدان مرحلة الشباب (البالغة من العمر 5 أيام) من ألواح أجار NGM الخمس باستخدام المخزن المؤقت S (الشكل 1 أ).
   1. لاختيار الديدان الحية فقط باستخدام طريقة السكروز 6 للتعويم على 30٪ (وزن / حجم) من السكروز ، امزج الديدان المعلقة في 3-4 مل من المخزن المؤقت S بحجم متساو من السكروز المثلج البارد 60٪ (وزن / حجم) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بتدوير الأنبوب عند 1,500 × جم لمدة 15 ثانية عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة الديدان العائمة في أنبوب جديد عن طريق تحريكها بعيدا عن جدار الأنبوب باستخدام ماصة باستور.
2. اغسل الديدان 3 مرات باستخدام المخزن المؤقت S عن طريق الطرد المركزي عند 1,500 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية. تحقق من الحجم الرطب للديدان المغسولة بعد الطرد المركزي باستخدام طرف ماصة دقيقة سعة 1,000 ميكرولتر (الشكل 1 ب).
3. أضف الديدان المغسولة إلى حجم متساو من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك المثلج البارد بنسبة 10٪ (وزن / حجم) (TCA ؛ التركيز النهائي 5٪) لترسيب البروتين (الشكل 1 ج). بدلا من TCA ، يمكن استخدام حمض البيركلوريك (PCA) أو حمض الميتافوسفوريك.
4. قم بتجانس الديدان مع المرسب باستخدام 40 ضربة من المدقة في خالط التفلون (مطحنة أنسجة Potter-Elvehjem) مع دوران يصل إلى 1,300 دورة في الدقيقة على الجليد.
5. انقل الجانس إلى أنبوب دقيق جديد سعة 1.5 مل باستخدام ماصة باستور ، وصوتنة باستخدام الخالط بالموجات فوق الصوتية لمدة 3 دقائق (3 مرات من 1 دقيقة) مع دورة عمل 20٪ على الجليد.
6. قم بتوضيح التجانس عن طريق الطرد المركزي عند 8,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتحييد المواد الطافية ب 4 M KOH (0.25 حجم إلى 10٪ TCA) لمدة 20 دقيقة على الجليد ، وجهاز الطرد المركزي عند 8,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. يمكن تخزين المادة الطافية (كعينة اختبار) عند -80 درجة مئوية حتى المقايسات التالية.

< p class = "jove_title" >3. فحص اللاكتات باستخدام مجموعة مقايسة القياس اللوني

1. قياس تركيز اللاكتات في عينات الاختبار باستخدام مجموعة الفحص اللوني (جدول المواد). إجراء فحوصات مزدوجة لعينات الاختبار. أضف 5 أو 10 ميكرولتر من عينات الاختبار إلى صفيحة سعة 96 بئرا واضبط الحجم على 50 ميكرولتر لكل بئر باستخدام Lactate Assay Buffer المرفق مع المجموعة.
2. بالنسبة لمنحنى اللاكتات القياسي ، قم بتخفيف 100 ملي من لتر (+) -لاكتات قياسي إلى 1 ملي مولار باستخدام Lactate Assay Buffer. أضف 0 و 2 و 4 و 6 و 8 و 10 ميكرولتر من معيار 1 ملي مولار لتر (+) -لاكتات ، والذي يتم توفيره مع المجموعة ، في سلسلة من الآبار.
3. أضف 50 ميكرولتر من مزيج التفاعل (يحتوي على 46: 2: 2 من مخزن فحص اللاكتات ، ومزيج إنزيم اللاكتات ، ومسبار اللاكتات في DMSO ، اللامائي ؛ يتم توفير جميع الكواشف مع المجموعة) أو مزيج التحكم في الخلفية (يحتوي على 48: 2 من Lactate Assay Buffer و Lactate Probe) في كل بئر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة بينما تكون العينات محمية من الضوء.
4. قم بقياس امتصاص كل بئر عند 570 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة واطرح امتصاص مزيج التحكم في الخلفية من امتصاص مزيج التفاعل.
5. ارسم منحنى اللاكتات القياسي. احسب تركيزات اللاكتات لعينات الاختبار من منحنى اللاكتات القياسي.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. عملية استخراج المستقلبات الخلوية. (أ) وضعت 1,500-3,000 دودة على صفيحة أجار NGM (طبق بتري 90 مم). كان الاستخراج من الديدان على خمس لوحات كافيا لفحوصات قياس الألوان. (ب) يشار إلى الديدان التي تم جمعها من الصفائح الخمس المكونة من 3,000 و 1,500 دودة لكل صفيحة على الجانب الأيسر والأيمن من اللوحة ، على التوالي. يبلغ حجم كل من الأحجام ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مجموعة الفحص اللوني / الفلوري لاكتات بيوفيجن #K607-100 اللونية / الفلورية < br / > 100 فحص. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية حمض ثلاثي كلورو أسيتيك واكو بيور كيميكال # 207-04955 يحفظ في درجة حرارة الغرفة الخالط تفلون إيواكي / بيركس # 358034 (ويتون) بدلا من Iwaki / Pyrex المتاح بواسطة Wheaton