مقايسة البيروفات لتقدير مستويات البيروفات في الكسور الخلوية للديدان

الملخص

المصدر: Yanase ، S. et al. فحوصات لونية صغيرة الحجم للاكتات داخل الخلايا والبيروفات في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو مقايسة لونية لقياس البيروفات كميا في الكسور الخلوية ل Caenorhabditis elegans. باستخدام بيروكسيد الهيدروجين الناتج عن التفاعل الأنزيمي للبيروفات أوكسيديز مع البيروفات الخلوي ، تتأكسد صبغة كروموجينيك لإنتاج منتج ملون ، يتم قياسه باستخدام قياس اللون لتحديد تركيز البيروفات.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الثقافة المتزامنة ل C. ايليجانس

1. قبل البذر ، استزراع الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية) سلالة OP50 بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في 300 مل من وسط مرق Luria-Bertani السائل. قم بتخزين OP50 المستنبت عند -4 درجة مئوية.
   1. لصنع وسط سائل مرق LB ، استخدم 10 جم من التربتون ، و 5 جم من مستخلص الخميرة ، و 10 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.5 مل من 1 نيوتروكسيد الصوديوم ، وأضفه إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. الأوتوكلاف.
      ملاحظه: تتوفر سلالات OP50 و C. elegans من مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (جامعة مينيسوتا ، سانت بول ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية).
2. لعمل أجار وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) ، استخدم 3 جم من كلوريد الصوديوم ، و 2.5 جم من البيبتون ، و 17 جم من الأجار ، و 975 مل من الماء منزوع الأيونات. الأوتوكلاف. تبرد إلى 55 درجة مئوية ، ثم تضاف معقمة ، بالترتيب ، 1 مل من 1 م MgSO₄ ، 1 مل من 1 M CaCl₂ ، 1 مل من 5 مجم / مل من الكوليسترول في EtOH ، و 25 مل من 1 M فوسفات البوتاسيوم الرقم الهيدروجيني 6.0 في أطباق بتري 90 مم.
   1. للحصول على 1 M من فوسفات البوتاسيوم درجة الحموضة 6.0 ، استخدم 108.3 جم من KH₂PO₄ و 46.6 جم من K₂HPO₄ ، وأضف الماء منزوع الأيونات إلى 1 لتر. الأوتوكلاف.
3. انشر 1-2 مل من OP50 المستنبت على ألواح أجار NGM. لعمل طبقة رقيقة من OP50 ، احتضن الألواح طوال الليل في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة أي ديدان خيطية.
   ملاحظه: يمكن تخزين ألواح أجار NGM الملقحة OP50 في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أسابيع.
4. أضف ما لا يقل عن 100 دودة على صفيحة أجار NGM مع OP50 ، وزراعتها عند 20 درجة مئوية حتى مرحلة البلوغ. مطلوب ثلاث لوحات على الأقل.
5. لجمع البيض في الرحم ، انقل خنثى الحمل من صفائح أجار NGM الثلاثة لكل منها 5 مل من المخزن المؤقت S في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، واغسل الديدان 3 مرات باستخدام 15 مل من المخزن المؤقت S باستخدام الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
   1. لعمل المخزن المؤقت S ، استخدم 5.9 جم من كلوريد الصوديوم و 50 مل من 1 متر من فوسفات البوتاسيوم الرقم الهيدروجيني 6.0 ، وأضفه إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. الأوتوكلاف.
6. قم بإذابة الديدان في محلول هيبوكلوريت قلوي للتفكيك وعزل البيض السائب (0.5 مل من المبيض الطازج أو ما يعادله: 5-6٪ هيبوكلوريت الصوديوم ، 0.1 مل من 10 M هيدروكسيد الصوديوم ، حوالي 4.5 مل من المخزن المؤقت S) ، وقم بوضع المحلول لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الخلط عن طريق القلب.
   ملاحظه: في غضون 15 دقيقة ، يجب أن تذوب الديدان البالغة ، تاركة محلولا ضبابيا من البيض محررا من جثثها (يجب تأكيد البويضات المحررة باستخدام مجهر مجسيمي). بدلا من 0.1 مل من 10 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم ، يمكن أيضا استخدام 0.2 مل من 5 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم.
7. بعد معالجة هيبوكلوريت ، اغسل حبيبات البيض 3 مرات باستخدام 15 مل من المخزن المؤقت S ، وأعد تعليقها في 5-6 مل من المخزن المؤقت S. يفقس البيض الذي تم إطلاقه أثناء الحضانة الليلية عند 20 درجة مئوية في المخزن المؤقت S بدون بكتريا قولونية لزراعة متزامنة مع العمر ليرقات المرحلة L1.
8. لتحديد العدد التقريبي ليرقات المرحلة L1 ، قم بحساب الديدان باستخدام مجهر مجسمة في 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت S بعد تعليق اليرقات 3 مرات على الأقل ، وحساب المتوسط. بعد ذلك ، قم بنقل يرقات المرحلة L1 إلى خمس ألواح أجار NGM مع OP50 (1،500-3،000 دودة لكل طبق باستخدام طبق بتري 90 مم) ، وزراعتها عند 20 درجة مئوية حتى تنمو إلى مرحلة الشباب البالغين عندما يبدأ الإخصاب الذاتي ويتم وضع عدد قليل من البيض (عادة بعد 3 أيام).

< p class = "jove_title" >2. استخراج الكسر الخلوي من C. ايليجانس

1. اجمع ديدان مرحلة الشباب (البالغة من العمر 5 أيام) من ألواح أجار NGM الخمس باستخدام المخزن المؤقت S (الشكل 1 أ).
   1. لاختيار الديدان الحية فقط باستخدام طريقة السكروز 6 للتعويم على 30٪ (وزن / حجم) من السكروز ، امزج الديدان المعلقة في 3-4 مل من المخزن المؤقت S بحجم متساو من السكروز المثلج البارد 60٪ (وزن / حجم) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بتدوير الأنبوب عند 1,500 × جم لمدة 15 ثانية عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة الديدان العائمة في أنبوب جديد عن طريق تحريكها بعيدا عن جدار الأنبوب باستخدام ماصة باستور.
2. اغسل الديدان 3 مرات باستخدام المخزن المؤقت S عن طريق الطرد المركزي عند 1,500 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية. تحقق من الحجم الرطب للديدان المغسولة بعد الطرد المركزي باستخدام طرف ماصة دقيقة سعة 1,000 ميكرولتر (الشكل 1 ب).
3. أضف الديدان المغسولة إلى حجم متساو من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك المثلج البارد بنسبة 10٪ (وزن / حجم) (TCA ؛ التركيز النهائي 5٪) لترسيب البروتين (الشكل 1 ج). بدلا من TCA ، يمكن استخدام حمض البيركلوريك (PCA) أو حمض الميتافوسفوريك.
4. قم بتجانس الديدان مع المرسب باستخدام 40 ضربة من المدقة في خالط التفلون (مطحنة أنسجة Potter-Elvehjem) مع دوران يصل إلى 1,300 دورة في الدقيقة على الجليد.
5. انقل الجانس إلى أنبوب دقيق جديد سعة 1.5 مل باستخدام ماصة باستور ، وصوتنة باستخدام الخالط بالموجات فوق الصوتية لمدة 3 دقائق (3 مرات من 1 دقيقة) مع دورة عمل 20٪ على الجليد.
6. قم بتوضيح التجانس عن طريق الطرد المركزي عند 8,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتحييد المواد الطافية ب 4 M KOH (0.25 حجم إلى 10٪ TCA) لمدة 20 دقيقة على الجليد ، وجهاز الطرد المركزي عند 8,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. يمكن تخزين المادة الطافية (كعينة اختبار) عند -80 درجة مئوية حتى المقايسات التالية.

< p class = "jove_title" >3. فحص البيروفات باستخدام مجموعة الفحص اللوني

1. قم بقياس تركيز البيروفات في المواد الطافية (عينات الاختبار) باستخدام مجموعة مقايسة القياس اللوني (جدول المواد). إجراء فحوصات مزدوجة لعينات الاختبار. أضف 10 ميكرولتر من عينات الاختبار و 90 ميكرولتر من كاشف العمل (يحتوي على 94: 1 من مزيج الإنزيم وكاشف الصبغة ، والتي يتم توفيرها مع المجموعة) في صفيحة 96 بئرا واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة بينما تكون العينات محمية من الضوء.
2. قم بقياس امتصاص كل بئر عند 570 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
3. ارسم منحنى البيروفات القياسي. احسب تركيزات البيروفات لعينات الاختبار من منحنى البيروفات القياسي.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. عملية استخراج المستقلبات الخلوية. (أ) وضعت 1,500-3,000 دودة على صفيحة أجار NGM (طبق بتري 90 مم). كان الاستخراج من الديدان على خمس لوحات كافيا لفحوصات قياس الألوان. (ب) يشار إلى الديدان التي تم جمعها من الصفائح الخمس المكونة من 3,000 و 1,500 دودة لكل صفيحة على الجانب الأيسر والأيمن من اللوحة ، على التوالي. يبلغ حجم كل من الأحجام الرطبة في كل أنبوب ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات طقم فحص EnzyChrom Pyruvate أنظمة المقايسة الحيوية #EPYR-100 المقايسات اللونية / الفلورومترية 100 ؛ يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية حمض ثلاثي كلورو أسيتيك واكو بيور كيميكال # 207-04955 يحفظ في درجة حرارة الغرفة الخالط تفلون إيواكي / بيركس # 358034 (ويتون) بدلا من Iwaki / Pyrex ، متاح بواسطة Wheaton