الفحص الطيفي لتحديد نشاط سينسيز الجليكوجين

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Wilson WA ، طرق القياس الطيفي لدراسة استقلاب الجليكوجين حقيقيات النواة. J. Vis. Exp. (2021).

يصف هذا الفيديو مقايسة الطيف الضوئي لتقدير نشاط سينسيز الجليكوجين. تعتمد الطريقة على تقليل امتصاص NADH بمرور الوقت وتشير إلى نشاط سينسيز الجليكوجين.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحديد نشاط سينسيز الجليكوجين

1. قم بإعداد محاليل مخزون الكواشف المطلوبة كما هو موضح في الجدول 1 (قبل يوم التجربة).
2. في يوم الفحص ، قم بإعداد محلول عمل جديد من 4 ملي مولار NADH عن طريق إذابة 4.5 مجم من NADH في 1.5 مل من 50 ملي Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0. يحفظ على الثلج ، محمي من الضوء.
3. قم بإذابة محاليل مخزون UDP-glucose و ATP و phosphoenolpyruvate و NDP kinase على الجليد.
4. قم بتسخين حمام مائي مسبقا إلى 30 درجة مئوية.
5. قم بإعداد كل مقايسة سينسيز الجليكوجين في أنبوب سعة 1.5 مل عن طريق إضافة كواشف خليط التفاعل المدرجة في الجدول 2.
   ملاحظه: لتسهيل الإعداد ، يمكن عمل مزيج رئيسي يحتوي على ما يكفي من كل من الكواشف المذكورة أعلاه لإكمال عدد المقايسات المخطط لها.
6. قم بإعداد تفاعل فارغ ، حيث يتم استبدال NADH في الخليط أعلاه بالماء. انقله إلى كوفيت ميثاكريليت يمكن التخلص منه واستخدمه لضبط الصفر على مقياس الطيف الضوئي عند 340 نانومتر.
7. خذ 770 ميكرولتر من كمية خليط التفاعل في أنبوب سعة 1.5 مل. أضف 2 ميكرولتر من كيناز NDP و 2 ميكرولتر من خليط نازعة هيدروجين البيروفات كيناز / اللاكتات ، واخلطها برفق ، واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لتسخين خليط التفاعل مسبقا.
8. أضف 30 ميكرولتر من العينة التي تحتوي على سينسيز الجليكوجين في 20 ملي مولار تريس عازلة ، درجة الحموضة 7.8 ؛ امزج وانقل خليط التفاعل إلى كوفيت ميثاكريليت يمكن التخلص منه.
9. ضع الكوفيت في مقياس الطيف الضوئي وسجل الامتصاص عند 340 نانومتر على فترات زمنية لمدة 10 إلى 20 دقيقة. ارسم الامتصاص الذي تم الحصول عليه مع مرور الوقت.
   ملاحظه: يجب إجراء تفاعل يتم فيه استبدال عينة سينسيز الجليكوجين بمخزن مؤقت Tris 20 ملي مولار للتحكم في الأكسدة غير الأنزيمية ل NADH. اعتمادا على نقاء العينة ، قد تكون هناك حاجة إلى تفاعلات تحكم أخرى.
10. تحديد معدل التفاعل.

< p class = "jove_content" >الجدول 1: حلول المخزون المطلوبة لفحص نشاط سينسيز الجليكوجين.

مكون الاتجاهات 50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8.0 قم بإذابة 0.61 جم من قاعدة تريس في ~ 80 مل من الماء. يبرد إلى 4 درجات مئوية. اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك واجعل الحجم يصل إلى 100 مل بالماء. 20 ملي مولار HEPES عازلة قم بإذابة 0.477 جم من HEPES في ~ 80 مل من الماء. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وقم بتعويض الحجم إلى 100 مل بالماء. 132 ملي مولار تريس / 32 ملي KCl الرقم الهيدروجيني 7.8 قم بإذابة 1.94 جم من قاعدة تريس و 0.239 جم من KCl في ~ 90 مل من الماء. اضبط درجة الحموضة على 7.8 باستخدام حمض الهيدروكلوريك وقم بتعويض الحجم إلى 100 مل بالماء. 0.8٪ وزن / حجم الجليكوجين المحار قم بوزن 80 مجم من جليكوجين المحار وأضفه إلى الماء. اجعل الحجم النهائي يصل إلى 10 مل بالماء وقم بتسخينه برفق / امزجه لإذابة الجليكوجين بالكامل. 100 ملي مولار UDP-جلوكوز قم بإذابة 0.31 جم من UDP-glucose في الماء واجعل الحجم النهائي يصل إلى 1 مل. يحفظ في كميات صغيرة ، مجمدة عند -20 درجة مئوية. مستقر لعدة أشهر. 50 ملي متر ATP قم بإذابة 0.414 جم من ATP في ~ 13 مل من الماء. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وقم بتكوين الحجم إلى 15 مل بالماء. يحفظ في كميات مجمدة عند -20 درجة مئوية. مستقر لعدة أشهر. 100 ملي مولار جلوكوز 6 فوسفات الرقم الهيدروجيني 7.8 قم بإذابة 0.282 جم من الجلوكوز -6 فوسفات في ~ 7 إلى 8 مل من الماء. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.8 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. اجعل الحجم يصل إلى 10 مل بالماء. يحفظ مجمدا في كميات صغيرة عند -20 درجة مئوية. مستقر لمدة ستة أشهر على الأقل. 40 ملي فوسفوينول بيروفات قم بإذابة 4 مجم من الفوسفوينول بيروفات في 0.5 مل من 20 ملي مولار HEPES المخزن الهيدروجيني 7.0. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية ، مستقر لمدة أسبوع واحد على الأقل. 0.5 م MnCl₂ قم بإذابة 9.90 جم من MnCl₂ في حجم نهائي من 100 مل من الماء. NDP كيناز أعد تكوين مسحوق مجفف بالتجميد بكمية كافية من الماء لإعطاء محلول 1 U / μl. تحضير الكميات ، وتجميدها في النيتروجين السائل ، وتخزينها في -80 درجة مئوية. مستقر لمدة 1 سنة على الأقل. < p class = "jove_content" >الجدول 2: خليط تفاعل التركيب لفحص نشاط سينسيز الجليكوجين.

مكون الحجم (ميكرولتر) 160 ملي مولار تريس / 32 ملي KCl الرقم الهيدروجيني 7.8 250 حيا الماء 179 100 ملي مولار جلوكوز 6 فوسفات ، درجة الحموضة 7.8 58 0.8٪ وزن/ف المحار جليكوجين 67 50 ملي متر ATP 80 4 ملي NADH 80 100 ملي مولار UDP-جلوكوز 28 40 ملي مولار فوسفوينول بيروفات 20 0.5 م MnCl₂ 8 المجلد النهائي 770

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أميلوبكتين (خالي من الأميلوز) من الذرة الشمعية فيشر ساينتيك أ 0456 أميلوز Biosynth Carbosynth YA10257 ATP ، ملح ثنائي الصوديوم MilliporeSigma أ 3377 د-جلوكوز -1،6-ثنائي الفوسفات، ملح البوتاسيوم MilliporeSigma جي 6893 د-جلوكوز -6-فوسفات ، ملح الصوديوم MilliporeSigma جي 7879 نازعة هيدروجين الجلوكوز 6 فوسفات ، الدرجة الأولى ، من الخميرة MilliporeSigma 10127655001 الجليكوجين ، النوع الثاني من المحار MilliporeSigma جي 8751 هيكسوكيناز MilliporeSigma 11426362001 كوفيت ميثاكريليت ، 1.5 مل فيشر ساينتيك 14-955-128 الميثاكريلات مطلوب لأن بعض الإجراءات يتم إجراؤها عند 340 نانومتر أو أقل β-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد فوسفات ملح الصوديوم MilliporeSigma N0505 β-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد ، ملح ثنائي الصوديوم المنخفض MilliporeSigma 43420 نيوكليوزيد 5'-ثنائي فوسفات كيناز MilliporeSigma ن0379 فوسفوينول بيروفات ، ملح أحادي البوتاسيوم MilliporeSigma ص 7127 فوسفوجلوكوموتاز من عضلة الأرانب MilliporeSigma ص 3397 الفوسفوريلاز أ من عضلة الأرانب MilliporeSigma ص 1261 إنزيمات بيروفات كيناز / نازعة هيدروجين اللاكتيك من عضلة الأرانب MilliporeSigma P0294 UDP-الجلوكوز ، ملح ثنائي الصوديوم MilliporeSigma طراز U4625