التحليل القائم على المعاوقة الخلوية لمراقبة العمليات الخلوية في الوقت الفعلي

الملخص

المصدر: Labadie، T.، et al.، مراقبة بقاء فيروس الأنفلونزا خارج المضيف باستخدام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نوضح عملية المراقبة في الوقت الفعلي للأحداث الخلوية ، بما في ذلك تكاثر الخلايا الملتصقة ، عبر مقايسة المعاوقة الخلوية. هنا ، تعمل الخلايا الملتصقة كعوازل ، مما يحد من تدفق التيار بين الأقطاب الكهربائية ويزيد من المقاومة.

البروتوكول

ملاحظة: أثناء جميع التجارب، احتفظ بالألواح على أسطح غير إلكتروستاتيكية في جميع الأوقات، مثل أغلفة الورق من العبوة. اتبع القسم 1 أدناه لتحديد أنسب تركيز للخلايا المراد زرعها في لوحة الميكروتيتر الإلكترونية (المصممة على أنها E-Plate).

< p class = "jove_title" >1. تحديد كمية الخلية المناسبة للخلايا المصابة

1. قم بإعداد خلايا MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) في قوارير 75 سم² للحصول على خلايا منقسمة حديثا (حوالي 80٪ التقاء) قبل 24 ساعة من التجربة.
2. اغسل الخلايا ب 5 مل من 1x PBS وافصلها عن طريق إضافة 3 مل من محلول Trypsin-EDTA بنسبة 0.25٪.
3. أضف 7 مل من وسط زراعة الخلايا الطازجة وعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي مع تلطيخ التريبان الأزرق.
4. اضبط تركيز الخلية على 400,000 خلية / مل باستخدام وسائط زراعة الخلايا. إجراء تخفيفات تسلسلية مزدوجة في أنابيب إضافية للحصول على كثافة خلوية تبلغ 200,000 ؛ 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; و 6,250 خلية / مل. اضبط نطاق تخفيف الخلايا وفقا لنوع الخلية وسلوك نموها.
5. اترك اللوحة الإلكترونية (جدول المواد) في RT لعدة دقائق وأضف 100 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. لا تلمس أقطاب اللوحة الإلكترونية.
6. افتح الحوامل وأدخل الواجهة الأمامية للوحة في جيب المهد لأداة قياس المعاوقة (جدول المواد). أغلق باب الحاضنة.
7. افتح البرنامج.
   1. في "الإعداد الافتراضي لنمط التجربة"، اختر الحامل (الحاملات) المحدد وانقر نقرا مزدوجا على الصفحة العلوية، ثم أدخل اسم التجربة. انقر فوق "تخطيط" وأدخل معلومات العينة اللازمة لكل بئر محدد من اللوحة ؛ ثم انقر فوق "تطبيق" عند الانتهاء. انقر فوق "جدولة" | "خطوات" | "إضافة خطوة". يضيف البرنامج تلقائيا خطوة قدرها 1 ثانية لقياس مقاومة الخلفية (CI).
   2. انقر فوق "بدء / متابعة" في علامة التبويب "تنفيذ". انقر فوق "مؤامرة" ، وأضف جميع العينات عن طريق تحديد الآبار المخصصة ، وتأكد من أن CI بين -0.1 و 0.1 قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
8. أخرج الطبق من المهد.
9. أضف 100 ميكرولتر من كل معلق خلية من الخطوة 1.4 في نسختين إلى الآبار المناسبة و 100 ميكرولتر من الوسائط الخلوية في الآبار المستخدمة كعناصر تحكم. اترك اللوحة الإلكترونية في غطاء التدفق الرقائقي لمدة 30 دقيقة في RT للسماح بالتوزيع المنتظم للخلايا في قيعان الآبار.
10. أدخل اللوحة الإلكترونية في جيب الحامل. انقر فوق "جدولة" | "إضافة خطوة" في البرنامج وأدخل قيما لمراقبة الخلايا كل 30 دقيقة ل 200 تكرار. ثم حدد "بدء / متابعة".
11. تحقق من بيانات CI ورسمها بالنقر فوق الزر "Plot" في البرنامج. حدد تركيز الخلايا التي تكون قبل المرحلة الثابتة مباشرة بعد 24 ساعة من البذر على اللوحة ، من أجل الحصول على الخلايا التي لا تزال في مرحلة النمو أثناء العدوى الفيروسية. يتم الوصول إلى المرحلة الثابتة عندما يكون CI في الحد الأقصى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات اللوحة الإلكترونية 16 (6 لوحات) شركة ACEA Biosciences، Inc 5469830001 اللوحات الإلكترونية متوفرة في عبوات مختلفة برنامج تلفزيوني 1X تقنيات الحياة (جيبكو) 14040091 TPCK-تريبسين ورثينجتون LS003740 أداة تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي xCELLigence S16 شركة ACEA Biosciences، Inc 380601310 تتوفر أدوات xCELLigence RTCA S16 بتنسيقات مختلفة (16 بئر ، 96 بئر ، مفردة أو متعددة الألواح) قارورة زراعة الأنسجة 75 سم 2 صقر 430641 وحدة ميم 1X تقنيات الحياة (جيبكو) 31095029