المقايسة الخلوية القائمة على المعاوقة لقياس تعدد العدوى بفيروس الأنفلونزا

الملخص

المصدر: Labadie، T.، et al.، مراقبة بقاء فيروس الأنفلونزا خارج المضيف باستخدام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نناقش العلاقة بين CIT₅₀ وتعدد الالتهابات الفيروسية. تظهر الخلايا المصابة بالفيروس تأثيرات اعتلال خلوي ، مما يتسبب في موتها وانفصالها عن القطب الكهربائي الصغير الذهبي ، مما يقلل بدوره من المقاومة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. العلاقة بين قيم CIT₅₀ وتعدد العدوى

1. أضف 100 ميكرولتر من وسط ثقافة 1x MEM المعقم في كل بئر من اللوحة الإلكترونية. أدخل اللوحة الإلكترونية في جيب حامل الجهاز عند 35 درجة مئوية.
2. قم بقياس الخلفية كما هو موضح:
3. افتح البرنامج.
   1. في "الإعداد الافتراضي لنمط التجربة"، اختر الحامل (الحاملات) المحدد وانقر نقرا مزدوجا على الصفحة العلوية، ثم أدخل اسم التجربة. انقر فوق "تخطيط" وأدخل معلومات العينة اللازمة لكل بئر محدد من اللوحة ؛ ثم انقر فوق "تطبيق" عند الانتهاء. انقر فوق "جدولة" | "خطوات" | "إضافة خطوة". يضيف البرنامج تلقائيا خطوة من 1 ثانية لقياس مقاومة الخلفية (CI).
   2. انقر فوق "بدء / متابعة" في علامة التبويب "تنفيذ". انقر فوق "مؤامرة" ، وأضف جميع العينات عن طريق تحديد الآبار المخصصة ، وتأكد من أن CI بين -0.1 و 0.1 قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
4. قم بإزالة اللوحة الإلكترونية من الحامل.
5. قم بزراعة 3 × 10⁴ من خلايا MDCK المنقسمة حديثا على كل بئر من لوحة الميكروتيتر الإلكترونية وقم بزراعتها لمدة 24 ساعة عند 35 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} بحيث تكون في مرحلة التكاثر أثناء الإصابة ب IAV.
6. قم بإصابة خلايا MDCK بتخفيفات مختلفة بمقدار 10 أضعاف من عيار 6log₁₀TCID₅₀/مل معروف لفيروس H1N1، باستخدام سحب العينات العكسي لقابلية التكاثر باتباع الخطوات التالية:
   1. اشطف خلايا MDCK 2x ب 100 ميكرولتر من MEM بدون FCS (وسائط انتشار الفيروس). كن على دراية بإزالة جميع الوسائط بعد الغسيل الثاني لتجنب المزيد من تخفيف اللقاح.
   2. أضف 100 ميكرولتر من المعلق الفيروسي في كل بئر باستخدام ماصة أحادية القناة. لتجنب التلوث ، تابع بالبدء من اليسار إلى اليمين ، ثم من أعلى إلى أسفل في اللوحة أثناء تغطية الآبار المتبقية بالغطاء.
   3. أدخل اللوحة في جيب مهد الجهاز عند 35 درجة مئوية. كن لطيفا لتجنب الحركات المفاجئة التي قد تؤدي إلى التلوث.
   4. ابدأ في مراقبة مقاومة الخلية كل 15 دقيقة خلال 100 ساعة على الأقل كما هو موضح:
      1. أدخل اللوحة الإلكترونية في جيب الحامل. انقر فوق "جدولة" | "إضافة خطوة" في البرنامج وأدخل قيما لمراقبة الخلايا كل 30 دقيقة ل 200 تكرار. ثم حدد "بدء / متابعة".
   5. بعد دورتي القياسات (أي 30 دقيقة) ، أوقف الجهاز مؤقتا بالنقر فوق "إيقاف مؤقت" في علامة التبويب "تنفيذ" وقم بإزالة اللوحة الإلكترونية من الحامل.
   6. أضف 1 ميكروغرام / مل TPCK-trypsin إلى وسائط انتشار الفيروس لشق الهيماجلوتينين الفيروسي.
   7. أضف 100 ميكرولتر من وسائط انتشار الفيروس التي تحتوي على TPCK-trypsin في كل بئر وأدخل الصفيحة الإلكترونية في جيب الحامل.
   8. انقر فوق "بدء / متابعة" في علامة التبويب "تنفيذ".
      ملاحظه: لا تنس إنشاء تحكم سلبي يتوافق مع الخلايا المصابة الوهمية عن طريق استبدال التعليق الفيروسي بوسائط انتشار الفيروس.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات اللوحة الإلكترونية 16 (6 لوحات) شركة ACEA Biosciences، Inc 5469830001 اللوحات الإلكترونية متوفرة في عبوات مختلفة ميم 1X تقنيات الحياة (جيبكو) 31095029 TPCK-تريبسين ورثينجتون LS003740 أداة تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي xCELLigence S16 شركة ACEA Biosciences، Inc 380601310 تتوفر أدوات xCELLigence RTCA S16 بتنسيقات مختلفة (16 بئر ، 96 بئر ، مفردة أو متعددة الألواح)