مقايسة حركية البقاء على قيد الحياة القائمة على المعاوقة الخلوية لتقييم بقاء الفيروس

الملخص

المصدر: Labadie، T. et al.، مراقبة بقاء فيروس الأنفلونزا خارج المضيف باستخدام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي. J. Vis. Exp. (2021).

يصف هذا الفيديو تقنية قائمة على المعاوقة الخلوية لدراسة حركية بقاء الفيروسات التي تحفز تأثيرات الاعتلال الخلوي. تقيس الطريقة المعاوقة الكهربائية للخلايا الملتصقة بالفيروس المعالجة مسبقا بالمحلول الملحي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكواشف والمواد الأولية

1. تحضير خلايا MDCK ووسط زراعة الخلايا المعقمة
   1. زراعة خلايا كلى Madin-Darby (MDCK) في وسط النسر المعدل (MEM) مع 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية المعطل بالحرارة (FCS) والمضادات الحيوية (100 وحدة / مل البنسلين ، 100 مجم / مل ستربتومايسين).
   2. بعد الذوبان ، قم بتمرير خلايا MDCK مرتين على الأقل قبل إصابتها لضمان الشفاء التام (ولكن أقل من 30 ممرا لتجنب أي انجراف في الأنماط الظاهرية للخلايا).
   3. قارورة (قوارير) زراعة الأنسجة بذرة 75 سم² تحتوي على 30 مل من 1x MEM المعقم مع 7.5 × 10⁶ خلايا MDCK وتحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
2. إعداد معدات مراقبة المعاوقة
   1. ضع الأداة في الحاضنة عند 35 درجة مئوية واتركها تسخن لمدة ساعتين على الأقل.
   2. قم بتوصيله بوحدة التحكم الموضوعة خارج الحاضنة.
   3. انتقل إلى إجراءات التنظيف على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة قبل البدء في ما تبقى من التجربة.
3. إنتاج مخزونات IAV على خلايا MDCK
   1. لتكاثر وتضخيم فيروسات H1N1 ، قم بزرع 7.5 × 10⁶ خلايا MDCK على قارورتين لزراعة الأنسجة مقاس 75 سم² ، واحتضانها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية للوصول إلى التقاء 90٪ -100٪.
   2. صب وسط زراعة الخلية من طبقة أحادية الخلية في قوارير 75 سم². اغسل الخلايا ب 5 مل من 1x PBS المعقمة.
   3. قم بإزالة PBS وأضف 5 مل من 1x PBS لغسل الخلايا مرة أخرى.
   4. قم بتسمية قارورة واحدة على أنها عنصر تحكم وقم بإزالة PBS قبل إضافة 15 مل من وسائط انتشار الفيروسات (1x MEM مع 0٪ FCS) بعناية على الطبقة الأحادية. احتضان هذه القارورة في حاضنة يتم الحفاظ عليها عند 35 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. استخدمه للمقارنة بعد 3 أيام من التكاثر.
   5. قم بإذابة قارورة واحدة من مخزون IAV في RT. قم بتخفيف الفيروس إلى التركيز المناسب في أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على وسائط انتشار الفيروس (1x MEM مع 0٪ FCS).
   6. قم بإزالة 1x PBS من قارورة 75 سم² وقم بإصابة خلايا MDCK بتعدد العدوى (MOI) 1 × ^10-3 أو 1 × ^10-4 وحدات تشكيل البلاك لكل خلية (pfu / خلية) عن طريق إضافة 1 مل من الفيروس المخفف إلى الطبقة الأحادية للخلية.
   7. امتصاص الفيروس إلى خلايا MDCK لمدة 45 دقيقة في RT عن طريق تقليب القارورة بانتظام كل 15 دقيقة.
   8. قم بإزالة اللقاح برفق وأضف 15 مل من وسائط انتشار الفيروس لكل قارورة تحتوي على 1 ميكروغرام / مل TPCK-trypsin (التربسين / L-1-tosylamide-2- فينيل إيثيل كلورو ميثيل كيتون) ، لشق الهيماجلوتينين الفيروسي HA0 إلى وحدات فرعية HA1 و HA2 (وهو حدث مطلوب لاندماج HA مع الغشاء الداخلي وإطلاق الجينوم الفيروسي).
   9. احتضان القوارير عند 35 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 3 أيام على الأقل لتكرار الفيروس.
   10. راقب خلايا MDCK تحت المجهر بتكبير 40x وابحث عن تأثيرات الاعتلال الخلوي (CPE) على الخلايا (من خلال مقارنتها بقارورة التحكم في الخلية). إذا لم يكتمل CPE (أي أن حوالي 80٪ من الخلايا منفصلة عن الركيزة) ، فضع القوارير مرة أخرى في الحاضنة لمدة 24 ساعة إضافية.
   11. عند اكتمال CPE ، قم بصب الطاف الطافي لزراعة الخلايا وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق لحبيبات الحطام الخلوي.
   12. انقل المادة الطافية المصفاة إلى أنبوب سعة 15 مل وفيروسات ذرية إلى قوارير مبردة معقمة تستخدم مرة واحدة. ضع الأنابيب المبردة على الفور عند -80 درجة مئوية لتجميد الفيروسات وتخزينها.
4. قم بإصابة خلايا MDCK بتخفيفات مختلفة بمقدار 10 أضعاف من عيار معروف 6 log₁₀ TCID₅₀/mL من فيروس H1N1، باستخدام سحب العينات العكسي لقابلية التكاثر باتباع الخطوات التالية:
   1. اشطف خلايا MDCK 2x ب 100 ميكرولتر من MEM بدون FCS (وسائط انتشار الفيروس). كن على دراية بإزالة جميع الوسائط بعد الغسيل الثاني لتجنب المزيد من تخفيف اللقاح.
   2. أضف 100 ميكرولتر من المعلق الفيروسي في كل بئر باستخدام ماصة أحادية القناة. لتجنب التلوث ، تابع بالبدء من اليسار إلى اليمين ثم من أعلى إلى أسفل في اللوحة أثناء تغطية الآبار المتبقية بالغطاء.
   3. أدخل اللوحة في جيب مهد الجهاز عند 35 درجة مئوية. كن لطيفا لتجنب الحركات المفاجئة التي قد تؤدي إلى التلوث.
   4. ابدأ في مراقبة مقاومة الخلية كل 15 دقيقة خلال 100 ساعة على الأقل كما هو موضح في الخطوة 2.10.
   5. بعد دورتي القياسات (أي 30 دقيقة) ، أوقف الجهاز مؤقتا بالنقر فوق "إيقاف مؤقت" في علامة التبويب "تنفيذ" وقم بإزالة اللوحة الإلكترونية من الحامل.
   6. أضف 1 ميكروغرام / مل TPCK-trypsin إلى وسائط انتشار الفيروس لشق الهيماجلوتينين الفيروسي.
   7. أضف 100 ميكرولتر من وسائط انتشار الفيروس التي تحتوي على TPCK-trypsin في كل بئر وأدخل الصفيحة الإلكترونية في جيب الحامل. 8. انقر فوق "بدء / متابعة" في علامة التبويب "تنفيذ".
      ملاحظه: لا تنس إنشاء تحكم سلبي يتوافق مع الخلايا المصابة الوهمية عن طريق استبدال التعليق الفيروسي بوسائط انتشار الفيروس.

< p class = "jove_title" >2. حركية البقاء على قيد الحياة IAV

1. قم بتعريض IAV للماء المقطر المالح عند 35 درجة مئوية واختبر مدى عدويتها بمرور الوقت عن طريق قياس انخفاض مقاومة الخلية.
   1. قم بإعداد الماء المقطر المالح عن طريق إضافة كلوريد الصوديوم إلى التركيز النهائي البالغ 35 جم / لتر في الماء المقطر. أضف 900 ميكرولتر من الماء المالح إلى أنابيب التبريد سعة 2 مل.
   2. أضف 100 ميكرولتر من المخزون الفيروسي في الماء المالح وضع الأنابيب المبردة في حاضنة (35 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة ساعة واحدة أو 24 ساعة أو 48 ساعة.
   3. بذور 100 ميكرولتر (تحتوي على 3 × 10⁴) من خلايا MDCK المنقسمة حديثا على صفيحة ميكروتيتر 16 بئرا وتنمو لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   4. يصيب الخلايا ب 100 ميكرولتر من الفيروسات المكشوفة (المخففة مسبقا 10 مرات في وسط الاستزراع) باستخدام طريقة سحب العينات العكسية للتكاثر عن طريق تكرار القسم 1.4.
2. راقب مقاومة الخلية كل 15 دقيقة لمدة 100 ساعة على الأقل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.25٪ تريبسين ثيرموفيشر 25200056 قارورة زراعة الأنسجة 75 سم 2 صقر 430641 وحدة اللوحة الإلكترونية 16 (6 لوحات) شركة ACEA Biosciences، Inc 5469830001 اللوحات الإلكترونية متوفرة في عبوات مختلفة FCS تقنيات الحياة (جيبكو) 10270-106 ميم 1X تقنيات الحياة (جيبكو) 31095029 برنامج تلفزيوني 1X تقنيات الحياة (جيبكو) 14040091 البنسلين - ستربتومايسين تقنيات الحياة (جيبكو) 11548876 TPCK-تريبسين ورثينجتون LS003740 أداة تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي xCELLigence S16 شركة ACEA Biosciences، Inc 380601310 تتوفر أدوات xCELLigence RTCA S16 بتنسيقات مختلفة (16 بئر ، 96 بئر ، مفردة أو متعددة الألواح