فحص المواد التفاعلية لحمض ثيوباربيتوريك لتقييم الإجهاد التأكسدي في مصل الدم البشري

الملخص

المصدر: Borges ، C. R. et al. ، تقييم الإجهاد التأكسدي في العينات البيولوجية باستخدام فحص المواد التفاعلية لحمض ثيوباربيتوريك. J. Vis. Exp. (2020)

< p class = "jove_content" >يوضح هذا الفيديو اختبار المواد التفاعلية لحمض الثيوباربيتوريك (TBARS) لتقييم الإجهاد التأكسدي في العينات البيولوجية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل المشاركين البشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسي المحلي

< p class = "jove_title" >1. اختبار TBARS

ملاحظة: بمجرد بدء اختبار TBARS ، يجب الانتهاء منه دون توقف.

1. خذ أكبر عدد ممكن من العينات والمعايير التي تم طردها عند 1500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، احتفظ بالأنابيب الزجاجية التي تحتوي على العينات والمعايير في RT. الأنابيب الزجاجية حسب الحاجة لعدد العينات المراد تحليلها وقم بتسميتها بأسماء العينات. ثم أضف 100 ميكرولتر من كل عينة محضرة (محللات خلية HepG2 ، والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة ، والمصل البشري) إلى كل أنبوب زجاجي.
2. أضف 200 ميكرولتر من 8.1٪ SDS إلى كل عينة وقياسية وقم بتدوير الأنبوب الزجاجي برفق بحركة دائرية لخلط العينة.
3. أضف 1.5 مل من المخزن المؤقت لأسيتات الصوديوم 3.5 M (الرقم الهيدروجيني = 4) إلى كل عينة ومعيار.
4. أضف 1.5 مل من المخزن المؤقت لأسيتات الصوديوم 3.5 M (الرقم الهيدروجيني = 4) إلى كل عينة ومعيار.
5. ارفع الحجم النهائي إلى 4 مل لكل عينة ومعيار عن طريق إضافة 700 ميكرولتر من ماء DI.
6. قم بتغطية كل أنبوب زجاجي بإحكام واحتضانه في كتلة تسخين مضبوطة على 95 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. قم بتغطية الأنابيب الزجاجية بورق الألمنيوم لمنع التكثيف في قمم الأنابيب.
7. قم بإزالة الأنابيب الزجاجية من كتلة التسخين واحتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة.
8. عينات ومعايير أجهزة الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، احتفظ بالأنابيب الزجاجية التي تحتوي على العينات والمعايير عند RT.
   ملاحظه: سيؤدي الاحتفاظ بالعينات على الجليد أو عند 4 درجات مئوية إلى ترسيب العينة أو المعيار بأكمله.
9. مباشرة بعد الطرد المركزي ، قم بإخراج 150 ميكرولتر من المادة الطافية من كل أنبوب وضعها في بئر منفصل من صفيحة 96 بئرا.
10. قم بإزالة أي فقاعات من كل بئر باستخدام طرف ماصة.
    ملاحظه: سيؤدي وجود الفقاعات إلى قراءات امتصاص غير متسقة ، مما يؤدي إلى عدم دقة عالية في المقايسة.
11. قراءة الامتصاص عند 532 نانومتر. اطرح متوسط قراءة الامتصاص للعينات الفارغة من جميع قراءات الامتصاص الأخرى.
12. قم بإنشاء منحنى قياسي عن طريق رسم قراءات الامتصاص المطروحة الفارغة عند 532 نانومتر مقابل التركيز المعروف لكل معيار. احتواء نقاط البيانات باستخدام الانحدار الخطي. احسب تركيزات العينة غير المعروفة باستخدام معادلة خط الانحدار الخطي الذي تم الحصول عليه من المنحنى القياسي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1x PBS معقم الرقم الهيدروجيني 7.4 1 لتر VWR ، بنسلفانيا 101642--262 كاشف تحلل الخلية 50 مل أنبوب طرد مركزي قائم بذاته كورنينج ، نيويورك CLS430897 مادة عامة 96 لوحة بئر ، غير معالجة ، شفافة ، مع غطاء ، غير معقمة ثيرمو فيشر العلمي ، ماجستير 280895 لقياس الامتصاص جهاز تصفية الدوران بالطرد المركزي Amicon Ultra-0.5 100 kD فيشر ساينتفيك ، نيو هامبشاير UFC510024 تنقية LDL أغطية للأنابيب الزجاجية ثيرمو فيشر العلمي ، ماجستير 14-930-15 د لفحص TBARS كلوريد النحاس الثاني سيجما ، ميزوري 222011-250 جرام للحث على الأكسدة أنابيب الاستزراع، يمكن التخلص منها، مع تشطيب بغطاء لولبي، زجاج البورسليكات (13 × 100 مم) VWR ، بنسلفانيا 53283-800 لفحص TBARS الحد الأدنى من الوسيط الأساسي للنسر (EMEM) ATCC ، فيرجينيا إتش بي -8065 وسائط خلية HepG2 أنابيب القفل الآمن من Eppendorf ، 1.5 مل إيبندورف ، نيويورك 22363204 مادة عامة أنابيب القفل الآمن من Eppendorf، 2.0 مل جينيسي سيتيفيك ، كاليفورنيا 22363352 مادة عامة مصل الأبقار الجنين مصدر الولايات المتحدة أوميغا ساينتيفيك ، كاليفورنيا FB-11 لزراعة الخلايا حمض الخليك الجليدي سيجما ، ميزوري هاتف: 27225-1L-R كاشف TBARS كوكتيل هلت مثبط البروتياز (100x) الثرمو العلمي ، ماجستير 87786 كاشف تحلل الخلية هيبس سيجما ، ميزوري H3375-250G مذيب LDL حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك ) فيشر ساينتفيك ، نيو هامبشاير أ 144-212 كاشف تحلل الخلية جهاز الطرد المركزي Legend Micro 17 الثرمو العلمي ، ماجستير 75002431 مادة عامة البروتين الدهني منخفض الكثافة ، البلازما البشرية أثينا للأبحاث والتكنولوجيا ، جورجيا 12-16-120412 النموذج الأولي للمصفوفة البيولوجية قضبان التحريك المغناطيسية ، مثمن 6 تشكيلة VWR ، بنسلفانيا 58948-025 مادة عامة مالوندي ألدهيد مكرر (ثنائي ميثيل أسيتال) سيجما ، ميزوري 8207560250 معيار TBARS Multiskan Go مقياس الطيف الضوئي Microplate فيشر ساينتفيك ، نيو هامبشاير 51119200 لقياس الامتصاص NP-40 شركة EMD ميليبور كورب ، ماساتشوستس 492016-100 مل كاشف تحلل الخلية كلوريد الصوديوم سيجما ، ميزوري S7653-1 كجم كاشف تحلل الخلية كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) سيجما ، ميزوري 436143-100 جرام كاشف TBARS هيدروكسيد الصوديوم سيجما ، ميزوري 367176-2.5 كجم كاشف TBARS مكثف SpeedVac الثرمو العلمي ، ماجستير SC250EXP لتركيز محللات الخلايا حمض ثيوباربيتوريك سيجما ، ميزوري تي 5500-100 جرام كاشف TBARS قاعدة TRIS فلوكا ، جورجيا 93362 كاشف تحلل الخلية