$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >1. التحضير
- أضف 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين (10000 وحدة / مل) و 5 مل و 10 مل من المكملات الغذائية المتوفرة تجاريا إلى 500 مل من الوسط الكلاسيكي الكامل مع المصل. Aliquot 50 مل من الوسيط في البداية.
ملاحظه: لا تعيد أي وسيط إلى المخزون لتجنب التلوث.
- ضع حصة من الوسط الكلاسيكي الكامل على الجليد.
- استخدم 70٪ إيثانول لتنظيف المجهر المفصل والملقط والمقص.
- قم بإعداد طبقين لزراعة الخلايا (10 سم) ، أحدهما على مجهر التشريح ، والآخر على الثلج ؛ ضع 10 مل من الوسط الكلاسيكي الكامل في كل طبق.
< p class = "jove_title" >2. الخطوات التجريبية (الشكل 1)
- التضحية بالفئران C57BL / 6J حول ما بعد الولادة (P) 20 باستخدام 75-100 مجم / كجم كيتامين و 7.5-10 مجم / كجم زيلازين محقون داخل الصفاق. حافظ على العينين في وسط كلاسيكي كامل على الجليد قبل التشريح.
- إزالة النسيج الضام (العضلات والأنسجة الدهنية) والعصب البصري على العين.
- استخدم مقصا صغيرا لقطع محيطي 0.5 مم خلف طيف القرنية. قم بإزالة مركب القرنية / القزحية والجسم الزجاجي والعدسة.
- قم بعمل شق 1 مم عموديا على الحافة المقطوعة باتجاه العصب البصري وقم بقطع شريط محيطي بعرض 1 مم. افصل بين المناطق الوسطى والطرفية للمجمع. استخدم الملقط لتقشير شبكية العين من مركب RPE / المشيمية / الصلبة.
- احتفظ بشريط المشيمية المحيطي في وسط كلاسيكي كامل على الجليد ؛ عزل العين الأخرى وكرر العملية لقطع شريط ثان.
- قطع الشريط الدائري إلى 6 ~ قطع مربعة متساوية (~ 1 مم × 1 مم).
ملاحظه: لا تلمس أي حافة.
- قم بإذابة مستخلص الغشاء القاعدي (BME) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أضف 30 ميكرولتر / بئر من BME في وسط كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا. تأكد من أن قطرة BME تشكل قبة محدبة في الجزء السفلي من اللوحة دون لمس الحواف.
ملاحظه: قم بإذابة BME طوال الليل في الثلاجة. يجب أن يكون BME على الجليد في أي وقت بعد الذوبان.
- ضع الأنسجة في منتصف BME.
ملاحظه: لا تقم بتسطيح المشيمية. بشكل عام ، دع الأنسجة تتمدد داخل BME. لا يؤثر اتجاه الأنسجة (الجانب الصلبي لأعلى أو لأسفل) على النتيجة التجريبية.
- احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للسماح للجل بالتصلب.
- أضف 500 ميكرولتر من الوسط / البئر الكلاسيكي الكامل.
- قم بتغيير الوسط الكلاسيكي كل يومين (500 ميكرولتر). يمكن ملاحظة تنبت المشيمية بعد 3 أيام بالمجهر.
ملاحظه: لعلاج عامل النمو ، قم بتجويع الأنسجة لمدة 4 ساعات. تمييع مركب تجريبي في وسط منخفض عامل النمو (1: 200 زيادة بدلا من 1:50).
< p class = "jove_title" >3. طريقة القياس الكمي المحوسبة SWIFT-Choroid (الشكل 2)
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: تم استخدام طريقة محوسبة لقياس المساحة التي تغطيها أوعية النمو. هناك حاجة إلى مكون إضافي ماكرو لبرنامج ImageJ قبل القياس الكمي.
- افتح صورة تنبت المشيمية باستخدام ImageJ وحدد "Image |النوع | 8 بت" بتدرج الرمادي.
- انتقل إلى "الصورة | ضبط | السطوع / التباين (Ctrl / shift / C)" وتحسين التباين.
- استخدم وظيفة العصا السحرية لتحديد وإزالة الأنسجة المشيمية الموجودة في وسط البراعم من الصورة (باستخدام مفتاح الاختصار "F1") (الشكل 2 أ ، ب).
ملاحظه: اضبط معدل تحمل العصا السحرية على 20-30٪.
- قم بإزالة خلفية الصورة باستخدام أدوات التحديد المجانية (الشكل 2 ج). انتقل إلى "الصورة | ضبط | العتبة (Ctrl / shift / T)". استخدم وظيفة العتبة لتحديد براعم الأوعية الدموية الدقيقة على الخلفية والمحيط (الشكل 2 د).
- انقر فوق "F2" وسيظهر ملخص. احفظ صورة للمنطقة المحددة بالنقر فوق "حفظ". احفظه في نفس المجلد مثل الصورة الأصلية للرجوع إليها في المستقبل.
- بعد قياس مجموعة من العينات ، انسخ المسجلة لتحليل البيانات.
ملاحظه: من الممكن أيضا قياس المساحة (ميكرومتر²) عن طريق "تحليل | تعيين المقياس" باستخدام الصور ذات أشرطة المقياس.
