مقايسة نشاط مستقبلات الإستروجين المراسل لفحص نشاط الاستروجين النباتي

الملخص

المصدر: Fender ، E. et al.، فحص الاستروجين النباتي باستخدام مقايسة β مراسل مستقبلات هرمون الاستروجين القائمة على الخلية. J. Vis. Exp. (2021).

يصف هذا الفيديو مقايسة مراسل قائمة على الخلايا لتحديد نشاط الاستروجين للمركبات المشتقة من النباتات. مركب ذو نشاط يشبه هرمون الاستروجين يحاكي ارتباطه بمستقبلات هرمون الاستروجين ويدفع نسخ جين إنزيم المراسل النهائي. يولد إنزيم المراسل تلألؤ بيولوجيا في تفاعل ، مما يشير إلى نشاط الاستروجين للمركب.

البروتوكول

1. مستقبلات هرمون الاستروجين البشري β فحص التعداء

ملاحظة: تقنية معقمة وغطاء تدفق رقائقي مطلوبة لليوم الأول من بروتوكول الفحص.

1. تحضير تخفيفات 17β-Estradiol للمنحنى القياسي.
   1. انقل وسيط استعادة الخلايا ووسط الغربلة المركب (CSM) من مخزن الفريزر وقم بإذابتها في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   2. تسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الوسيطة 1 و 2 (INT1 ، INT2) و 1-8.
   3. املأ INT1 ب 995 ميكرولتر من CSM ، و INT2 ب 615 ميكرولتر من CSM ، والأنبوب 1 ب 900 ميكرولتر من CSM ، والأنابيب 2-8 ب 600 ميكرولتر من CSM. ضع الأنبوب 8 جانبا.
   4. نقل 5 ميكرولتر من 100 ميكرومتر 17β-Estradiol Stock إلى INT1. تجاهل النصيحة. دوار.
   5. قبل كل عملية نقل، اشطف الماصة 3 مرات، ثم انقل 10 ميكرولتر من INT1 إلى INT2. تجاهل النصيحة.
   6. اشطف الماصة 3 مرات، ثم انقل 100 ميكرولتر من INT2 إلى الأنبوب 1. تجاهل النصيحة. نقل 300 ميكرولتر من الأنبوب 1 إلى الأنبوب 2. كرر مع الأنابيب من 3 إلى 7. تخلص من 300 ميكرولتر من الأنبوب 7 في حاوية النفايات. الأنبوب 8 هو صفر ولا يتلقى الاستراديول. التركيزات النهائية للمعايير المطلية هي: 400 ، 133.3 ، 44.44 ، 14.815 ، 4.938 ، 1.646 ، 0.5487 ، و 0 جزء من الاستراديول.
2. تحضير عينات المركبات.
   1. عينات دوامة.
   2. خذ 4 ميكرولتر من كل عينة نباتية في DMSO وأضفها إلى 496 ميكرولتر من CSM للحصول على محلول DMSO بنسبة 0.8٪.
3. إذابة خلايا المراسل بسرعة.
   1. استرجع أنبوب وسط استعادة الخلية من حمام مائي 37 درجة مئوية. تطهير السطح الخارجي باستخدام 70٪ إيثانول.
   2. استرجع خلايا المراسل من التخزين -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج عن طريق نقل 10 مل من CRM الدافئ مسبقا إلى أنبوب الخلايا المجمدة.
   3. أغلق أنبوب خلايا المراسل وانقلها إلى حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
   4. استرجع أنبوب تعليق خلية المراسل من الحمام المائي. اقلب أنبوب الخلايا عدة مرات برفق لتفتيت مجاميع الخلايا وإنتاج معلق متجانس. نظف سطح الأنبوب بنسبة 70٪ من الإيثانول.
4. طلاء الفحص.
   1. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من نظام تعليق خلية المراسل في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
   2. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من العينات في ثلاث نسخ في آبار الفحص المناسبة.
   3. انقل اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية ومرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 22-24 ساعة.
5. قم بإزالة ركيزة الكشف عن الذوبان ومخزن الكشف في ثلاجة مظلمة طوال الليل للتحضير لليوم 2.
6. قبل نهاية حضانة اللوحة مباشرة ، قم بإزالة ركيزة الكشف ومخزن الكشف المؤقت من الثلاجة وضعه في منطقة الإضاءة المنخفضة حتى يتم موازنه مع RT. بمجرد الوصول إلى RT ، اقلب كل أنبوب برفق عدة مرات لخلط المحاليل جيدا.
   1. مباشرة قبل اكتمال الحضانة ، اسكب محتويات المخزن المؤقت للكشف بالكامل في أنبوب ركيزة الكشف لإنشاء كاشف الكشف عن اللوسيفيراز. تخلط بلطف حتى لا تنتج رغوة.
   2. بمجرد اكتمال الحضانة ، اقلب اللوحة للتخلص من المحتويات في حاوية نفايات مناسبة. اضغط برفق على اللوحة على منشفة ورقية نظيفة ماصة لإزالة القطرات الأخيرة من الآبار.
   3. أضف 100 ميكرولتر من كاشف الكشف عن لوسيفيراز إلى كل بئر. اترك لوحة الفحص ترتاح عند RT لمدة 15 دقيقة. لا تهز اللوحة.
7. حدد كمية اللمعان باستخدام مقياس إضاءة لقراءة الألواح بسعة 96 بئرا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ماصة 1000 ميكرولتر ماصة 20 ميكرولتر ماصة 200 ميكرولتر حمام مائي 37 درجة مئوية 37 درجة مئوية ، حاضنة CO2 مرطبة بنسبة 5٪ 70٪ إيثانول الميزان التحليلي غطاء التدفق الصفحي المصنف لزراعة الخلايا ثنائي ميثيل سلفوكسيد حوض وسائط يمكن التخلص منه ، معقم نظام الترشيح بالتنقيط قوارير إرلينماير 125 مل و 250 مل HPLC الصف الميثانول نظام فحص مراسل ERβ البشري ، فحوصات بتنسيق 1 × 96 بئر نيلي للعلوم البيولوجية IB00411 مجموعة الفحص - تحلل 24 عينة بالإضافة إلى المنحنى القياسي مجفف التقويم ماصة متعددة القنوات شاكر المداري مقياس الإضاءة لقراءة الألواح على سبيل المثال Bioteck Synergy HTX المبخر الدوار قوارير القاع المستديرة 50 مل و 300 مل أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المعقمة أو أحواض الوسائط المعقمة متعددة القنوات نصائح معقمة 200 ميكرولتر و 1000 ميكرولتر ورقة واتمان الصف 1 حقائب دوامة باك أكياس البولي إيثيلين المعقمة