نقل طاقة رنين فورستر الذي تم حله بمرور الوقت لمراقبة فسفرة البروتين في الخلايا

الملخص

المصدر: Padros، J. et al.، فحوصات نقل طاقة الرنين Förster التي تم حلها بمرور الوقت لقياس بروتينات STAT الفسفرية الداخلية في الخلايا البشرية. J. Vis. Exp. (2021).

يصف هذا الفيديو نقل طاقة رنين Förster الذي تم حله بمرور الوقت أو مقايسة TR-FRET لتحديد فسفرة البروتين الداخلي بمساعدة الفلوروفورات المانحة والمتقبلة الموسومة على الأجسام المضادة الخاصة ببروتين الاختبار. تم تصميم هذه التقنية لقياس فسفرة بروتينات الاختبار في محللات الخلايا.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. زراعة الخلايا

1. الحفاظ على الخلايا في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والزراعة إما باستخدام DMEM المكمل بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) (خلايا HeLa و A431) أو RPMI مكمل بنسبة 15٪ FBS (خلايا U266B1). استزراع الخلايا حتى تصل إلى التقاء 70-80٪ ، ثم قم بتربسينها ومرورها أو استخدامها في المقايسات.
   ملاحظه: احتوت وسائط الثقافة على الفينول الأحمر. لم يتم إجراء تجويع في الدم لأي خط خلوي قبل إجراء الفحوصات.

2. معايرة المحفز أو المثبط باستخدام بروتوكول الفحص ثنائي الصفيحة مع الخلايا الملتصقة

ملاحظة: يصف هذا الإجراء كيفية تحديد فاعلية المحفز أو المثبط عن طريق إنشاء منحنى استجابة التركيز من سلسلة تخفيف لمركب الاختبار.

1. بذر الخلايا
   1. قم بتوزيع 50 ميكرولتر من الخلايا بالكثافة المحسنة مسبقا (40,000 خلية HeLa / بئر لكل من STAT3 و STAT6 ؛ 75,000 خلية A431 / بئر ل STAT5) في صفيحة معالجة بزراعة الأنسجة المكونة من 96 بئر في وسط الثقافة المناسب. احتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
      ملاحظه: يجب تحديد كثافة الخلايا المثلى ووقت حضانة الثقافة.
2. تخفيفات مركبات الاختبار
   1. قم بإعداد سلسلة تخفيف وسيطة 2x من مركب (مركبات) الاختبار عن طريق التخفيف المتسلسل (التخفيف الفاصل الزمني نصف اللوغاريتمي) عبر 12 بئرا من لوح البولي بروبلين 96 بئرا في الوسط الخالي من المصل.
      ملاحظه: يوصى بإجراء منحنى استجابة تركيز من 12 نقطة ، نصف لوغاريتمي في نسخ على الأقل لتقدير دقيق EC₅₀ أو IC₅₀.
   2. بدلا من ذلك ، بالنسبة لمركبات الاختبار القابلة للذوبان في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) الكارهة للماء (DMSO) ، قم بإجراء التخفيفات الأولية في DMSO بنسبة 100٪ ثم قم بتخفيف سلسلة التخفيف المركب إلى وسط خال من المصل.
      ملاحظه: يجب تحديد تفاوت الفحص مع DMSO قبل إجراء اختبار معايرة مركب في مركبة DMSO. من المهم الحفاظ على تركيزات المذيبات المتساوية بين الخلايا المعالجة وغير المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، عند اختبار التخفيفات التسلسلية للمركبات ، يجب أن تظل تركيزات المذيبات ثابتة دائما عبر سلسلة التخفيف.
3. علاج الخلايا
   1. لتحفيز الخلايا ، أضف 50 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل وحده (الخلايا غير المعالجة) أو الذي يحتوي على المحفز (2x).
   2. احتضان للوقت الأمثل مسبقا إما في درجة حرارة الغرفة (RT) أو 37 درجة مئوية (الإنترفيرون (IFN) α2b / 20 دقيقة في RT ل STAT3 ؛ عامل نمو البشرة (EGF) / 10 دقائق عند RT ل STAT5 ؛ إنترلوكين (IL) -4/20 دقيقة في RT ل STAT6). انتقل بعد ذلك إلى القسم 2.4.
      ملاحظه: يجب تحديد درجة حرارة الحضانة المثلى.
   3. لتثبيط الخلايا ، أضف 25 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل وحده (الخلايا غير المعالجة) أو الذي يحتوي على المثبط (4x).
   4. احتضان للوقت الأمثل مسبقا إما عند RT أو 37 درجة مئوية (مثبط JAK 1/30 دقيقة عند RT ل STAT3 و STAT6 ؛ Erlotinib / 15 دقيقة في RT ل STAT5).
   5. أضف 25 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل وحده (الخلايا غير المعالجة) أو يحتوي على المحفز (4x) في EC₈₀.
   6. احتضان الوقت المحسن مسبقا إما عند RT أو 37 درجة مئوية (نفس الظروف المبللة في الخطوة 2.3.2).
4. تحلل الخلايا
   1. قم بإعداد عازل التحلل المكمل 1x الخاص بالمجموعة كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
      ملاحظه: من الضروري استكمال 1x Lysis Buffer مع كوكتيل مثبط الفوسفاتيز 100x المخفف إلى تركيز نهائي قدره 1x. يحتوي 1x Supplemented Lysis Buffer على 1 ملي مولار من فلوريد الصوديوم ، و 2 ملي مولار من أورثوفانادات الصوديوم ، و 2 ملي مولار بيتا جليسيروفوسفات. مثبطات الفوسفاتيز الأخرى ليست مطلوبة ويجب تجنبها. لا ينصح باستخدام مخازن التحلل ومثبطات الفوسفاتيز بخلاف تلك المدرجة في المجموعة لأنها قد تحتوي على مكونات يمكن أن تتداخل مع القياس.
   2. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا والتخلص منه بعناية عن طريق شفط المادة الطافية.
   3. أضف على الفور 50 ميكرولتر من 1x Supplemented Lysis Buffer.
      ملاحظه: يمكن تحسين حجم المخزن المؤقت للتحلل (25-50 ميكرولتر).
   4. احتضان لمدة 30 دقيقة عند RT تحت الاهتزاز (ضبط شاكر اللوحة المدارية عند 400 دورة في الدقيقة ؛ تحريك معتدل).
      ملاحظه: يمكن تحسين وقت حضانة التحلل (30-60 دقيقة). يمكن استخدام المحللات على الفور للكشف عن البروتين المستهدف أو تجميدها عند -80 درجة مئوية.
5. الكشف عن TR-FRET
   1. قم بإعداد مزيج الكشف عن الأجسام المضادة 4x في 1x Detection Buffer كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
   2. في خطوة النقل هذه، قم بعمل ماصة بعناية 15 ميكرولتر من محللة الخلية من لوحة الاستزراع المكونة من 96 بئرا إلى بئر صفيحة بيضاء منخفضة الحجم 384 بئرا.
   3. أضف 15 ميكرولتر من محلول التحكم الإيجابي و 15 ميكرولتر من 1x Lysis Buffer (التحكم السلبي) لفصل آبار الفحص.
   4. أضف 5 ميكرولتر من مزيج الكشف عن الأجسام المضادة 4x (إما Eu-Ab1 / FR-Ab2 للكشف عن بروتين الفوسفو أو Eu-Ab3 / FR-Ab4 للكشف عن البروتين الكلي) لكل من آبار الفحص.
   5. قم بتغطية اللوحة بمادة مانعة للتسرب واحتضانها لمدة 1 ساعة حتى بين عشية وضحاها في RT ، اعتمادا على الفحص (انظر ورقة البيانات الفنية المقابلة).
      ملاحظه: يجب تحسين وقت القراءة الأمثل لكل اختبار وخط خلية. يمكن قراءة اللوحة عدة مرات دون تأثير سلبي على أداء الفحص.
   6. قم بإزالة مانع تسرب اللوحة اللاصقة واقرأ اللوحة على قارئ الألواح الدقيقة المتوافق مع TR-FRET.
      ملاحظه: يوصى باستخدام مقاييس الفلور القائمة على المرشح ، على الرغم من أنه يمكن استخدام بعض الأدوات أحادية اللون. تحقق من تثبيت الوحدة البصرية المناسبة (المرشحات والمرآة) ل TR-FRET. استخدم الطول الموجي للإثارة يبلغ 320 أو 340 نانومتر لإثارة مخلب Europium. اقرأ المقايسات عند كل من 615 نانومتر (أو 620 نانومتر) و 665 نانومتر للكشف عن كل من الانبعاث من المانح يوروبيوم والفلوروفور المستقبل ، على التوالي. ستعتمد إعدادات الأداة على القارئ المعين. تم الحصول على البيانات المعروضة هنا باستخدام الإثارة القائمة على المصباح ، وتأخير 90 ميكرو ثانية ، ووقت تكامل 300 ميكرو ثانية ، و 100 ومضة لكل بئر. ومع ذلك ، تمت قراءة اختبار phospho-STAT4 باستخدام الإثارة بالليزر لتوليد نسب أعلى من الإشارة إلى الخلفية (S / B).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات صفيحة دقيقة 96 جيدا ، شفافة ، قاع مسطح ، بوليسترين ، معالجة بزراعة الأنسجة ، معقمة كورنينج 3595 هذه هي اللوحة لزراعة الخلايا عند استخدام بروتوكول الفحص المكون من لوحين يمكن استخدام ألواح ثقافة الخلايا الأخرى المكونة من 96 بئرا 384 بئر صفيحة ، بيضاء ، منخفضة الحجم بيركين إلمر 6007290 هذه هي اللوحة للكشف عن TR-FRET عند استخدام بروتوكولات الفحص ذات اللوحين أو اللوح الواحد. يمكن استخدام ألواح بيضاء أخرى منخفضة الحجم سعة 384 بئرا خط خلية A431 ATCC [رل-1555] ختم صفيحة لاصقة بيركين إلمر 6050185 وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) Wisent 319-005-CL THUNDER TR-FRET متوافق مع وسط الثقافة الذي يحتوي على الفينول الأحمر قارئ الألواح EnVision Xcite متعدد الملصقات بيركين إلمر 2104-0020 أ يمكن إجراء المقايسات على مجموعة متنوعة من قارئات الألواح المجهزة بخيار TR-FRET خط خلية HeLa ATCC CCL-2 معهد روزويل بارك التذكاري 1640 متوسط (RPMI) Wisent 350-007-CL THUNDER TR-FRET متوافق مع وسط الثقافة الذي يحتوي على الفينول الأحمر التربسين / EDTA 0.05٪ Wisent 325-542-CL مياه فائقة النقاء غير أ غير أ استخدم الماء بدرجة Milli-Q (18 MΩ.cm) لتخفيف عازلة التحلل ومخزن الكشف