الفحص القائم على اللمعان لتقييم السمية العصبية لمركبات الاختبار على الخلايا العصبية

الملخص

المصدر: Wahlestedt ، C. ، et al. ، مقايسة نمو العصبية وتقييم السمية العصبية مع الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا العصبية البشرية. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نصف طريقة قائمة على اللمعان لتقييم السمية العصبية لمركبات الجزيئات الصغيرة المعززة لنمو الخلايا العصبية على جدوى الخلايا العصبية المشتقة من hNPC. يقيس الاختبار مستوى ATP داخل الخلايا ، وهو مؤشر على صلاحية الخلية ، لتقييم السمية العصبية بعد العلاج المركب للاختبار.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل المشاركين البشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسي المحلي

< p class = "jove_title" >1. عزل واستزراع الخلايا السلفية العصبية البشرية (hNPCs)

1. ضع أنسجة المخ في طبق بتري 100 مم وقم بإزالة السحايا بعناية باستخدام الملقط.
2. انقل أنسجة المخ إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل واغسله مرتين باستخدام 20 مل من PBS عن طريق قلب الأنبوب برفق.
3. احتضان أنسجة المخ في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل عن طريق غمر الأنسجة في محلول تفكك الخلايا (انظر جدول المواد) و DNase I (10 U / mL) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
4. أضف 5 مل من وسط زراعة الخلايا العصبية (انظر جدول المواد) إلى الأنبوب المحتوي على أنسجة المخ وقم بفصل المجالات العصبية ميكانيكيا عن طريق التخلي من 20 إلى 30 مرة من خلال طرف ماصة 1000 ميكرولتر لعمل تعليق أحادي الخلية.
5. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر لإزالة مجموعات الخلايا.
6. قم بزرع معلق الخلية المفردة في قارورة T-25 ذات فتحات تهوية مع 5-10 مل من وسط زراعة الخلايا العصبية المكملة بالمكونات المفصلة في الجدول 1.
   1. تعقيم محلول الهيبارين عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. مكمل B-27 بدون فيتامين أ هو مكمل خال من المصل لزراعة الأسلاف العصبية والخلايا الجذعية دون إحداث التمايز.
      ملاحظه: يتم عزل الخلايا السلفية العصبية البشرية (hNPCs) من دماغ الجنين البشري الذي تم جمعه من جنين مجهض. بعد 7-10 أيام في المزرعة ، تشكل الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) مستعمرات الغلاف العصبي العائمة بحرية ، بينما تظل أنواع الخلايا الأخرى معلقة كخلايا مفردة أو ترتبط بأسفل القارورة. يمكن زراعة hNPCs المعزولة كمجالات عصبية معلقة لعدة أشهر.

2. تمرير hNPCs

1. اجمع الوسائط التي تحتوي على الكرات العائمة ، والمجالات العصبية الكبيرة والصغيرة ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
   ملاحظه: لأسباب غير معروفة ، يتغير توقيت تقسيم المجالات العصبية من 7 أيام إلى 30 يوما. ومع ذلك ، بشكل عام ، يجب تمرير المجالات العصبية عندما يصل قطرها إلى أكثر من 700-900 ميكرومتر. يحدث هذا عندما يبدأ مركز الغلاف العصبي في التغميق ، وهو ما يعتبر علامة على ارتفاع معدل موت الخلايا.
2. قم بتدوير المجالات العصبية لأسفل عن طريق الطرد المركزي عند 300-400 × جم لمدة 3 دقائق.
3. استنشق المادة الطافية بعناية ثم اغمر الكرات في 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا المذابة (انظر جدول المواد).
   1. قم بعمل حصص من كاشف تفكك الخلية عن طريق إضافة 500 ميكرولتر لكل 1.5 مل من الأنابيب الدقيقة وتخزينها عند -20 درجة مئوية. لتجنب فقدان نشاط الإنزيم ، قم بإذابة كاشف تفكك الخلية عن طريق الاحتفاظ به في RT أو تسخينه لمدة 5 دقائق في حمام ماء / حبة 37 درجة مئوية.
4. اعتمادا على كثافة وحجم الكرات ، احتضان الكرات المغمورة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة.
5. أضف 5-10 مل من وسائط الثقافة الدافئة مسبقا إلى المجالات العصبية التي تحتوي على 50 مل من الأنبوب المخروطي وأجهزة الطرد المركزي عند 300-400 × جم لمدة 5 دقائق لترسيب المجالات العصبية.
6. شفط المادة الطافية وقم بسحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل، باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر، في 2 مل من وسائط المزرعة حتى تصبح جميع المجالات العصبية في معلق أحادي الخلية.
   ملاحظه: سيصبح الانفصال مرئيا للعين المجردة. قبل التفكك ، تكون المجالات العصبية على شكل كرات. بعد الغمر في كاشف التفكك وعن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل ، ستصبح خلايا مفردة.
   1. عد الخلايا المفردة ووصفحها ، من 2 إلى 3 ملايين خلية لكل قارورة T-25 ، في 10 مل من وسائط الاستزراع.
7. قم بتغذية الخلايا كل 3 أيام عن طريق استبدال نصف وسائط الاستزراع.
   1. قم بتسوية المجالات العصبية عن طريق إمالة القارورة بحيث تكون في الزاوية السفلية. امسك القارورة في الموضع لمدة 1-2 دقيقة حتى تترسب المجالات العصبية. ثم استنشق نصف الوسائط برفق عن طريق إدخال الماصة المصلية في الوسط فوق المجالات العصبية المستقرة. يمكن أن تتجمع الخلايا المنفصلة لتشكيل الكرات بعد 2 إلى 3 أيام في المزرعة.

< p class = "jove_title" >3. تجميد hNPCs

1. قم بإعداد وسط تجميد الخلية عن طريق إضافة DMSO إلى وسائط الاستزراع إلى تركيز نهائي قدره 10٪ (حجم / حجم) أو استخدم وسيط حفظ بالتبريد متاح تجاريا لأنواع الخلايا الحساسة (انظر جدول المواد).
2. قم بفرز الكرات الكبيرة عن طريق نقل الوسائط إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وترك الكرات تستقر عن طريق الجاذبية. ثم قم بإزالة ونقل المجالات العصبية الكبيرة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل للمرور باستخدام طرف ماصة سعة 200 أو 1000 ميكرولتر.
   ملاحظه: تعتبر المجالات العصبية التي يزيد قطرها عن 900 ميكرومتر كبيرة ، وتعتبر المجالات التي يقل قطرها عن 500 ميكرومتر صغيرة.
3. قم بتدوير المجالات العصبية المتبقية لأسفل عن طريق الطرد المركزي عند 300-400 × جم لمدة 3 دقائق.
4. أعد تعليق ما يصل إلى 100 كرة في 1 مل من كاشف الحفظ بالتبريد وانقله إلى أنبوب تبريد.
5. يخزن طوال الليل عند -80 درجة مئوية في حاوية تجميد الخلية (انظر جدول المواد) وانقله إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي للتخزين طويل الأجل.
   ملاحظه: يفضل تجميد المجالات العصبية الصغيرة والمتوسطة الحجم (التي يقل قطرها عن 900 ميكرومتر) وتجنب تجميد المجالات العصبية كبيرة الحجم (أكبر من 900 ميكرومتر في القطر) أو الخلايا المفردة. من أجل تقليل تلف الخلايا أثناء إذابة العينة ، حافظ على كثافة الخلايا عن طريق زرع المجالات العصبية المذابة في قارورة T25 صغيرة.

< p class = "jove_title" >4. تقييم السمية العصبية

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يتم تقييم السمية الخلوية لمركبات الاختبار في ألواح 384 بئرا (انظر جدول المواد) باستخدام مقايسة صلاحية الخلية المضيئة (انظر جدول المواد). يتم إعداد hNPCs باتباع نفس الطريقة ، باستثناء التعديلات الطفيفة ، الموضحة في قسم "تمايز ومعالجة hNPCs". بعد ذلك ، يتم قياس إشارة مضيئة ناتجة عن مقايسة بقاء الخلية المضيئة باستخدام قارئ صفيحة دقيقة. تتناسب الإشارة المضيئة مع تركيز ATP الخلوي ، والذي يتناسب في حد ذاته طرديا مع عدد الخلايا القابلة للحياة الموجودة في كل بئر.

1. طلاء
   1. أضف 30 ميكرولتر من بولي إل ليسين (PLL) لكل بئر من صفيحة 384 بئر.
   2. احتضان لمدة 1 ساعة في RT.
   3. اغسل 2x مع PBS.
   4. اتركه يجف في RT (لمدة 30 دقيقة تقريبا).
   5. أضف 30 ميكرولتر من اللامينين (50 ميكروغرام / مل) لكل بئر من صفيحة 384 بئر.
   6. احتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
   7. اغسل 2x باستخدام PBS.
      ملاحظه: يمكن تخزين الألواح المطلية ب 384 جيدا عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
2. طلاء الخلايا
   1. عد ولوحة 20,000 من المجالات العصبية أحادية الخلية لكل بئر من صفيحة 384 بئرا في 25 ميكرولتر من وسائط التمايز.
   2. احتضن لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية.
   3. بعد 5 أيام ، عالج الخلايا لمدة 24 ساعة بواسطة مركبات الاختبار المحضرة عند 6 أضعاف التركيز النهائي المطلوب في حجم 5 ميكرولتر (لعمل الحجم النهائي 30 ميكرولتر لكل بئر).
3. مقايسة بقاء الخلية
   1. أضف 30 ميكرولتر من كاشف فحص صلاحية الخلية المضيئة لكل بئر من لوح 384 بئر.
      ملاحظه: أضف حجما من كاشف فحص قابلية الخلية المضيئة يساوي الحجم الموجود في كل بئر. قم بإذابة كاشف مقايسة صلاحية الخلية المضيئة وقم بتوازنها مع RT قبل الاستخدام.
   2. رج العبوة على شاكر الطبق لمدة دقيقتين (لخلط وتحفيز تحلل الخلايا).
   3. قم بتدوير الخليط عن طريق الطرد المركزي عند 300-400 × جم لمدة 30 ثانية.
   4. احتضان اللوحة المكونة من 384 بئرا لمدة 10 دقائق في RT في مكان محمي من الضوء (لتثبيت إشارة الإنارة
   5. سجل اللمعان باستخدام قارئ الألواح الدقيقة.
      ملاحظه: استخدم أدوات التحكم المناسبة لمقايسة الجدوى ، بما في ذلك Velcade (بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر) كإيجابي و HBSS يحتوي على DMSO (بتركيز نهائي قدره 0.1٪ أو 0.2٪) كعنصر تحكم سلبي.

الجدول 1. المكونات المطلوبة لصنع 100 مل من وسائط الاستزراع

مبلغ مكون 100 ميكرولتر EGF (20 نانوغرام / مل) 100 ميكرولتر FGF (10 نانوغرام / مل) 2 مل B-27 ، ناقص فيتامين أ (50X) 1 مل L-alanyl-L-glutamine (100X) (انظر جدول المواد) 4 ميكرولتر الهيبارين (2 ميكروغرام / مل) 96.8 مل وسط زراعة الخلايا العصبية (انظر جدول المواد)

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مضاد حيوي - مضاد للفطريات جيبكو 15240062 ب 27 الحراريه 17504001 ب 27 - ناقص فيتامين أ الحراريه 12587010 BDNF بيبروتك 450-02 جيش صرب البوسنه سيغما أ 8531 سيل تيتر جلو بروميجا جي 7572 كول سيل كورنينج 432000 حاويات تجميد الخلايا تضمن المعدل القياسي المتحكم فيه -1 درجة مئوية / دقيقة تجميد الخلايا في فريزر -80 درجة مئوية كرايو ستور CS10 تقنيات الخلايا الجذعية 7930 وسط الحفظ بالتبريد يحتوي على 10٪ DMSO DMEM / F12 جيبكو 11320033 DMSO سيغما 34869-100 مل EGF جيبكو PHG0311 FGF جيبكو PHG6015 GDNF بيبروتك 450-10 جلوتاماكس جيبكو 35050061 مكمل L-alanyl-L-الجلوتامين الهيبارين كالبيوكيم 375095 لامينين سيغما L2020-1MG حمض الأسكوربيك سيغما A92902-25G إم فري ريال تقنيات الخلايا الجذعية 5854 وسط حفظ بالتبريد الخالي من المصل مصمم للحفظ بالتبريد للخلايا الجذعية الجنينية البشرية والمستحثة متعددة القدرات N2 جيبكو 17502048 Nunc 384-Well البوليسترين الأبيض Microplates الحراريه هاتف: 164610 برنامج تلفزيوني الحراريه 10010-049 بولي إل ليسين سيغما P5899-5 ملغ StemPro Accutase جيبكو A1110501 كاشف تفكك الخلايا الذي يحتوي على إنزيمات محللة للبروتين وتحلل الكولاجينات الوسط العصبي القاعدي جيبكو 21103049