مقايسة تكميل لوسيفيراز سبليت لتحديد تفاعلات محددة بين البروتين والبروتين

Abstract

المصدر: Wiertelak، W. et.al.، عرض توضيحي للمجمعات غير المتجانسة التي شكلتها بروتينات الغشاء من النوع الثالث المقيمة في جولجي باستخدام مقايسة تكميل لوسيفيراز المنقسمة. J. Vis. إكسب. (2020)

يوضح هذا الفيديو مقايسة تكميل لوسيفيراز الانقسام للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين. في هذا الاختبار ، يتم تمييز البروتينات ذات الأهمية على أجزاء صغيرة وكبيرة من إنزيم لوسيفيراز. عندما تتفاعل البروتينات ، تتحد الأجزاء الكبيرة والصغيرة لتشكيل مركب إنزيم نشط ، والذي في وجود ركيزة معينة ، يطلق لمعانا ساطعا يمكن قياسه.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. تعداء عابر للبلازميدات المعبر في الخلايا

1. حصاد HEK293T زراعة الخلايا الملتصقة عن طريق التربسين وأعد تعليق الخلايا في وسط نمو كامل مخصص. ضع الخلايا (2 × 10⁴/100 ميكرولتر / بئر) على قاع شفاف ، جانب أبيض 96 بئر. اضبط العدد الإجمالي للآبار لاستيعاب جميع المجموعات وعناصر التحكم المختبرة بما في ذلك التكرارات.
   ملاحظه: حاول استخدام 60 بئرا داخليا فقط من اللوحة لتقليل التحولات الحرارية وتجنب التبخر بين عشية وضحاها. يوصى بشدة باستخدام الألواح المطلية ب poly-D-lysine مثل تلك الموضحة في جدول المواد ، وإلا فقد تنفصل الخلايا أثناء خطوات الغسيل اللاحقة.
2. استزراع الخلايا طوال الليل في الظروف القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}).
3. في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا بالتركيبات المرغوبة من البلازميدات التعبيرية.
   1. تمييع بلازميدات التعبير في وسط خال من المصل (انظر جدول المواد) إلى 6.25 نانوغرام / ميكرولتر لكل بناء.
   2. أضف كاشف التعداء القائم على الدهون بنسبة الدهون إلى الحمض النووي المناسبة واحتضانه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   3. أضف 8 ميكرولتر من الدهون: خليط الحمض النووي إلى الآبار المخصصة. امزج محتوى اللوحة عن طريق الدوران اللطيف. ينتج عن هذا تعداء كلا البنيين للتعبير عند 50 نانوغرام / بئر.
4. استزراع الخلايا لمدة 20-24 ساعة في الظروف القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}).
   ملاحظه: قد يؤدي زراعة الخلايا لفترة أطول إلى مستويات أعلى من تعبير بروتين الاندماج ، مما قد يعزز ارتباطا غير محدد بين الأجزاء.

2. تبادل متوسط

1. في اليوم التالي ، استبدل الوسط المكيف ب 100 ميكرولتر من وسط خال من المصل في كل بئر. تأكد من أن الخلايا لم تنفصل عند التبادل المتوسط.
   ملاحظه: يجب أن تتم هذه الخطوة قبل 2-3 ساعات من إضافة محلول عمل فوريمازيني. يقلل سحب المصل من الخلفية الناتجة عن التلألؤ التلقائي للفوريمازين.

< p class = "jove_title" >3. تحضير حل عمل فوريماازين

1. قبل القياس مباشرة ، امزج حجما واحدا من furimazine مع 19 مجلدا من مخزن التخفيف (تخفيف 20 ضعفا).
   ملاحظه: يعتمد الحجم الإجمالي لمحلول عمل الفوريماازين المراد تحضيره على عدد الآبار الفردية المراد تحليلها (يضاف محلول عمل فوريمازين إلى وسط زراعة الخلية بنسبة 1: 5 ، لذلك ، إلى كل بئر مملوء مسبقا ب 100 ميكرولتر من وسط خال من المصل يجب إضافة 25 ميكرولتر من محلول عمل فوريمازيني).
2. أضف محلول عمل فوريمازين إلى الآبار المحددة (25 ميكرولتر / بئر). امزج اللوحة برفق يدويا أو باستخدام شاكر مداري (على سبيل المثال ، 15 ثانية عند 300-500 دورة في الدقيقة).

< ص الفئة = "jove_title" >4. قياس التلألؤ

1. أدخل اللوحة في قارئ اللفائح الدقيقة المضيئة.
   1. بالنسبة للتجارب التي سيتم إجراؤها عند 37 درجة مئوية ، قم بموازنة اللوحة لمدة 10-15 دقيقة عند درجة الحرارة المحددة.
2. حدد الآبار المراد تحليلها.
3. اقرأ التلألؤ بزمن تكامل يبلغ 0.3 ثانية. استمر في مراقبة التلألؤ لمدة تصل إلى ساعتين عند الحاجة.

Materials