مقالة منهجية

مقايسة التلألؤ الكهربائي الكيميائي لقياس مستويات البروتين المستهدفة في محللة الدماغ

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Steinkellner، H.، et al.، اختبار قائم على التلألؤ الكيميائي الكهربائي لمتغيرات بروتين MeCP2. J. Vis. Exp. (2020).

في هذا الفيديو ، نوضح المقايسة المناعية للتلألؤ الكهربي للكيمياء لتقدير مستويات البروتين المستهدفة في عينات مختلفة. يعتمد هذا الاختبار على اللمعان الناتج عن التفاعل الكهروكيميائي. تتناسب شدة الضوء المنبعث مع كمية البروتين المستهدف في العينة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE

1. بروتوكول MeCP2-ECLIA

  1. تحضير محلول الغسيل ، وانسداد المخزن المؤقت ، ومحلول مخفف الفحص (اليوم 1)
    1. أضف 500 ميكرولتر من Tween 20 إلى 1 L من PBS لتحضير 0.05٪ Tween 20 في محلول PBS ، واخلطه بقوة وقم بتسميته على أنه "محلول غسيل".
      ملاحظه: تأكد من استخدام مخزن الغسيل الطازج فقط.
    2. تحضير محلول مانع من 3٪ مانع A (جدول المواد) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). تخلط عن طريق التحريك الخفيف ، وتصفية وتعقيمها وتحتفظ بها في الثلاجة حتى الاستخدام لمدة أسبوعين كحد أقصى.
    3. أضف 5 مل من محلول الحجب إلى 10 مل من PBS لتحضير محلول مخفف للفحص (1٪ مانع A في PBS).
  2. طلاء ألواح عالية الربط
    1. أخرج لوحة ربط عالية أحادية البقع متعددة المصفوفات ذات 96 بئر.
      ملاحظه: تتمتع الألواح عالية الربط بقدرة ربط أكبر وبالتالي نطاق ديناميكي أكبر من الألواح القياسية ذات الأسطح الكارهة للماء.
    2. قم بإذابة الجسم المضاد للفأر أحادي النسيلة المضاد ل MeCP2 على الجليد واخلط 0.67 ميكرولتر من الجسم المضاد مع 4 مل من PBS (1: 6,000 تخفيف الجسم المضاد في PBS). دوامة محلول الجسم المضاد للخلط جيدا وتسمية الأنبوب بأنه "محلول طلاء".
    3. قم بتوزيع 25 ميكرولتر من محلول الطلاء بعناية في الزاوية السفلية من كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات؛ وهذا ما يسمى طريقة طلاء المحلول. اضغط على اللوحة المكونة من 96 بئرا برفق على كل جانب للتأكد من أن محلول الطلاء يغطي قاع كل بئر.
    4. أغلق الطبق بورق لاصق واحتضن الطبق في الثلاجة عند 4 درجات مئوية طوال الليل (12-16 ساعة).
  3. الحظر (اليوم 2)
    1. أخرجي الطبق من الثلاجة وأزيلي ورق القصدير.
    2. قم بإزالة محلول طلاء الجسم المضاد عن طريق نقره في سلة النفايات واضغط على اللوحة على منشفة ورقية لإزالة كل محلول الطلاء من الآبار.
    3. أضف 125 ميكرولتر من محلول الحجب لكل بئر. أغلق اللوحة مرة أخرى وضعها على شاكر صفيحة دقيقة مدارية.
    4. احتضان اللوحة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر عند 800 دورة في الدقيقة.
  4. تحضير المعايير والعينات
    1. خلال وقت الحضانة ، قم بإعداد معايير البروتين MeCP2 و / أو TAT-MeCP2 والعينات المختلفة.
      ملاحظه: يجب أن يكون المخزن المؤقت للتحلل المستخدم في التخفيف القياسي هو نفسه المستخدم في العينات التي تم تحليلها.
    2. أخرج قارورة واحدة من محلول مخزون البروتين MePC2 و / أو TAT-MeCP2 (250 ميكروغرام / مل) ، ومحللات دماغ الفأر ، وتحلل HDF من -80 درجة مئوية. قم بإذابة الثلج على الجليد.
      3. قم
    3. بتخفيف محلول المخزون القياسي (MeCP2 و / أو TAT-MeCP2) في أنابيب نظيفة وفقا للجدول 1.
    4. قم بتخفيف العينات في محلول التحلل على النحو التالي: 1-20 ميكروغرام من محللة دماغ الفأر لكل 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل ، و 0.25-1 ميكروغرام من محللة HDF لكل 25 ميكرولتر من محلول التحلل. قم بإعداد حجم كاف من كل عينة لإجراء التحليل في ثلاث نسخ.
  5. إضافة العينات والحلول القياسية
    1. قم بإزالة محلول المنع عن طريق نقره في سلة النفايات والنقر على اللوحة على منشفة ورقية لإزالة كل محلول الانسداد من الآبار.
    2. اغسل الطبق 3 مرات ب 150 ميكرولتر من محلول الغسيل عن طريق إضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور.
    3. أضف 25 ميكرولتر من المعايير والعينات إلى الزاوية السفلية من البئر باستخدام ماصة أحادية القناة.
    4. أغلق اللوحة واحتضن اللوحة لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر عند 800 دورة في الدقيقة.
  6. الجسم المضاد للكشف غير المسمى
    1. قم بإذابة الجسم المضاد للأرانب متعدد النسيلة المضاد ل MeCP2 على الجليد. تمييع الجسم المضاد 1: 6,000 في محلول مخفف للفحص.
    2. قم بإزالة المعايير والعينات عن طريق وضعها في سلة النفايات والنقر على اللوحة على منشفة ورقية.
    3. اغسل الطبق 3 مرات ب 150 ميكرولتر من محلول الغسيل عن طريق إضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور.
    4. أضف 25 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف غير المسمى إلى كل بئر باستخدام الماصة متعددة القنوات. أغلق اللوحة واحتضانها لمدة 1 ساعة مع اهتزاز مستمر عند 800 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. الجسم المضاد المترافق المحدد
    1. أخرج الجسم المضاد الثانوي المحدد (جدول المواد) من الثلاجة وضعه على الثلج. خفف الجسم المضاد 1: 666.67 في محلول مخفف للفحص واخلطه برفق.
    2. قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي المجاني غير المسمى عن طريق نقره في سلة النفايات والنقر على اللوحة على منشفة ورقية.
    3. اغسل الطبق 3 مرات ب 150 ميكرولتر من محلول الغسيل عن طريق إضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور.
    4. أضف 25 ميكرولتر من الجسم المضاد المترافق المحدد (جدول المواد) إلى كل بئر باستخدام الماصة متعددة القنوات. أغلق اللوحة واحتضانها لمدة 1 ساعة مع الاهتزاز المستمر عند 800 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. قراءة اللوحة
    1. قم بإزالة الجسم المضاد المترافق الحر (جدول المواد) عن طريق نقره في سلة النفايات والنقر على اللوحة على منشفة ورقية.
    2. اغسل الطبق 3 مرات بمحلول غسيل 150 ميكرولتر.
    3. أضف 150 ميكرولتر من 1x مخزن مؤقت للقراءة الذهبية القائم على Tris (جدول المواد) مع خافض للتوتر السطحي يحتوي على ثلاثي بروبيلأمين كمتفاعل مشترك لتوليد الضوء إلى اللوحة. تجنب أي فقاعات هواء باستخدام تقنيات سحب العينات العكسية.
    4. ضع اللوحة على منصة الكشف عن الصفيحة الدقيقة (جدول المواد) وابدأ القياس على الفور. استخدم الإعدادات للحصول على لوحة 96 بئرا.
    5. التقط إشارات التلألؤ الكهروكيميائي بواسطة كاميرا CCD مدمجة في نظام الكشف عن التلألؤ الكهركيميائي (جدول المواد) وسجل عدد الإشارات ، والتي تتوافق مع وحدات الضوء النسبي (RLU) وتتناسب طرديا مع شدة الضوء.
      ملاحظه: عند التحفيز الكهروكيميائي ، ينبعث ملصق الروثينيوم المرتبط بقطب الكربون ضوء تلألؤ عند 620 نانومتر. تحليل البيانات باستخدام البرنامج المصاحب للأداة (جدول المواد).
< p class = "jove_content" >الجدول 1: السلسلة القياسية من 0 إلى 1,800 نانوغرام / مل.

معيار تركيز التخفيف المعيار 1 1,800 نانوغرام/مل 1.08 ميكرولتر محلول مخزون قياسي + 148.92 ميكرولتر عازلة للتحلل قياسي 2 600 نانوغرام / مل 50 ميكرولتر معيار 1 + 100 ميكرولتر عازلة التحلل قياسي 3 200 نانوغرام / مل 50 ميكرولتر معيار 2 + 100 ميكرولتر عازلة التحلل قياسي 4 66.67 نانوغرام / مل 50 ميكرولتر معيار 3 + 100 ميكرولتر عازلة تحلل قياسي 5 22.22 نانوغرام / مل 50 ميكرولتر معيار 4 + 100 ميكرولتر عازلة تحلل قياسي 6 7.41 نانوغرام / مل 50 ميكرولتر معيار 5 + 100 ميكرولتر عازلة تحلل قياسي 7 2.47 نانوغرام / مل 50 ميكرولتر معيار 6 + 100 ميكرولتر عازلة تحلل قياسي 8 0.82 نانوغرام / مل 50 ميكرولتر معيار 7 + 100 ميكرولتر عازلة تحلل قياسي 9 0.27 نانوغرام / مل 50 ميكرولتر معيار 8 + 100 ميكرولتر عازلة التحلل قياسي 10 0 نانوغرام / مل 150 ميكرولتر عازلة التحلل

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات بروتين الانصهار TAT-MeCP2 الإنتاج الداخلي علاج الخلايا مانع MSD أ تشخيص مقياس Meso R93BA-4 بلوكير توين 20 سيجما ألدريتش ص 9416 محلول الغسيل متعدد النسيلة Anti-MeCP2 ، أنتج في الأرانب Eurogentec S.A. مصممة خصيصا جسم أحادي النسيلة Anti-MeCP2 ، ينتج في الفأر ، استنساخ Mec-168 ، الغلوبولين المناعي المنقى سيجما ألدريتش M6818-100UL ؛ RRID:AB_262075 الأجسام المضادة ، محلول الطلاء لوحة متعددة المصفوفات 96 بئر تشخيص مقياس Meso L15XB-3 / L11BX-3 بروتوكول MeCP2 ECLIA AB الثانوي ، الأرنب ، مضاد ل MeCP2 Eurogentec S.A. تقليد جسم AB الثانوي ، الأرنب ، مضاد ل MeCP2 ميرك 07-013 جسم MeCP2 (الإنسان) البروتين المؤتلف (P01) شركة أبنوفا H00004204-P01 علاج الخلايا المخزن المؤقت للقراءة الذهبية T (1x) مع خافض للتوتر السطحي تشخيص مقياس Meso R92TG بروتوكول MeCP2 ECLIA تصوير قطاع MSD 2400 تشخيص مقياس Meso I30AA-0 بروتوكول MeCP2 ECLIA منضدة عمل ديسكفري 4.0 اكتشاف مقياس الميزو برمجيات Dulbecco's PBS (معقم) سيجما ألدريتش D8537-500 مل تحضير العينة ، محلول الغسيل ، محلول الطلاء EDTA سيجما ألدريتش EDS مخزن الاستخراج

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة