مقالة منهجية

فحص Dot Blot لتحديد الجينوم الفيروسي

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Powers، J. M. et al.، A Quantitative Dot Blot للمعايرة بالتحليل الحجمي AAV واستخدامه للتقييم الوظيفي للبروتينات المنشطة لتجميع الفيروسات المرتبطة بالغدان.J. Vis. Exp. (2018).

في هذا الفيديو ، نصف مقايسة اللطخة النقطية لتحديد الجينوم الفيروسي. ترتبط شدة الإشارة ارتباطا مباشرا بكمية الحمض النووي الفيروسي في العينة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يتم توفير وصفات للحلول والمخازن المؤقتة اللازمة لهذا البروتوكول في الجدول 1.

1. لطخة النقطة

  1. إعداد معايير الحمض النووي البلازميد
    1. تمييع الحمض النووي لبلازميد الجينوم ناقلات AAV إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر في الماء أو مخزن ثلاثي حمض الهيدروكلوريك (10 ملي مولار ، درجة الحموضة 8.0). خذ 25 ميكرولتر من هذا التخفيف وهضمه بإنزيم تقييد مناسب لمدة 1 ساعة لخطية الحمض النووي البلازميد في حجم تفاعل 50 ميكرولتر.
      ملاحظه: نصنع مجموعة مكررة من الهضم (انظر الخطوة 1.4.1). يجب أن يكون الإنزيم المناسب هو الإنزيم الذي يقطع الحمض النووي البلازميد خارج منطقة ربط مسبار اللطخة النقطية. للراحة ، يمكن اقتباس الحمض النووي البلازميد المخفف (25 ميكرولتر / أنبوب) وتخزينه مجمدا عند -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. هضم الحمض النووي البلازميد أثناء اهتزاز الأنابيب في الخطوة 5.1. لا تفرط في هضم معيار الحمض النووي البلازميد.
    2. أضف 450 ميكرولتر من الماء أو TE إلى الأنبوب الذي يحتوي على معيار الحمض النووي البلازميد المهضوم واخلطه جيدا. انقل 70 ميكرولتر من هذا الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل مع 1,330 ميكرولتر من الماء أو TE لعمل معيار بلازميد مخفف (25 بيكوغرام/ميكرولتر).
    3. اتبع الجدول 1 لإنشاء مجموعة من التخفيفات التسلسلية ذات الشقين (600 ميكرولتر / أنبوب). امزج التخفيفات جيدا عن طريق الدوامة لمدة 5 ثوان.
  2. تغيير طبيعة المعايير وعينات الحمض النووي الفيروسي
    1. أضف 600 ميكرولتر من محلول قلوي 2x إلى كل تخفيف قياسي. تخلط جيدا عن طريق الدوامة لمدة 5 إلى 10 ثوان. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    2. أضف 120 ميكرولتر من محلول قلوي 2x إلى كل عينة من الحمض النووي الفيروسي. تخلط جيدا عن طريق الدوامة لمدة 5 إلى 10 ثوان. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  3. إعداد جهاز اللطخة النقطية
    1. باستخدام المقص ، قم بقص غشاء نشاف (على سبيل المثال ، مسبار زيتا) إلى حجم مناسب لعدد العينات والمعايير. انقع الغشاء بالماء لمدة 10 دقائق قبل وضعه على جهاز لطخة نقطية. قم بتغطية الآبار غير المستخدمة على جهاز الغشاء.
      ملاحظه: تعامل مع الغشاء مع ملاقط نظيفة. لتغطية الآبار الفارغة ، يمكن استخدام ورقة الحماية باللون الأزرق الفاتح التي تأتي مع الغشاء. لا تدع الغشاء يجف قبل ربط العينات والمعايير. لمزيد من التفاصيل حول تجميع الجهاز واستخدامه ، يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم.
    2. أضف الماء إلى الآبار التي سيتم تحميل العينات عليها. استخدم الفراغ واسحب الماء عبر الآبار للتحقق من وجود أخطاء وإعادة الاختبار عند إصلاحها. أعد شد البراغي أثناء تطبيق الفراغ لضمان إحكام الإحكام.
      ملاحظه: قد يتسبب الختم غير المكتمل في تسرب العينة بين الآبار.
    3. بمجرد سحب الماء بالكامل ، حرر الفراغ تماما (على سبيل المثال ، يجب أن يكون مشعب التفريغ مفتوحا لضغط الهواء).
  4. تحميل المعايير والعينات على جهاز اللطخة النقطية
    1. ضع 400 ميكرولتر من كل معيار بلازميد مخفف على كل بئر ، وقم بتشغيل أربعة ممرات من التخفيفات القياسية. استخدم حصتين منفصلتين من الملخص القياسي وقم بتحميل كل منهما في نسختين. ضع 200 ميكرولتر / بئر من كل عينة من الحمض النووي الفيروسي.
      ملاحظه: باستخدام ~ 40 ميكرولتر المتبقية من العينات المشوهة ، يمكن تحضير عينات مخففة (على سبيل المثال ، عينات مخففة بمقدار 10 أضعاف باستخدام 20 ميكرولتر من العينة بالإضافة إلى 180 ميكرولتر من محلول قلوي 1x) ومسحها إذا لزم الأمر.
    2. ضع مكنسة كهربائية لطيفة لسحب محاليل الحمض النووي عبر البئر.
      ملاحظه: يجب ضبط ضغط الفراغ عن طريق فتح صمام ثلاثي الاتجاهات جزئيا بحيث يتم تطبيق ضغط الفراغ على جهاز اللطخة النقطية وكذلك الغلاف الجوي (على سبيل المثال ، مع وضع أذرع محبس بزاوية 45 درجة تقريبا حيث يصدر ضوضاء شفط أعلى).
    3. بمجرد إفراغ جميع الآبار ، حرر الفراغ عن طريق ضبط الصمام ثلاثي الاتجاهات. أضف 400 ميكرولتر من محلول قلوي 1x إلى كل بئر يحتوي على معايير وعينات. انتظر لمدة 5 دقائق قبل إعادة تطبيق الفراغ لتفريغ الآبار.
    4. أعد تطبيق المكنسة الكهربائية بنفس الطريقة.
      5. قم
    5. بتفكيك جهاز اللطخة النقطية تحت الفراغ ، وقم بإزالة الغشاء ، واشطفه باستخدام 2x SSC. ضع الغشاء على منشفة ورقية نظيفة بحيث يكون الجانب المرتبط بالحمض النووي متجها لأعلى لإزالة 2x SSC الزائد.
    6. الأشعة فوق البنفسجية - ربط الحمض النووي النشاف بالغشاء باستخدام الوصلة المتشابكة المناسبة للأشعة فوق البنفسجية ؛ الغشاء جاهز الآن للتهجين.
      ملاحظه: يمكن استخدام الأغشية الرطبة للتشابك بالأشعة فوق البنفسجية. يمكن تخزين الأغشية المجففة المتشابكة بالأشعة فوق البنفسجية في درجة حرارة الغرفة. يمكن العثور على مزيد من المعلومات في جدول المواد.
فئة

2. التهجين والغسيل

  1. قم بتسخين عازلة التهجين في حمام مائي 65 درجة مئوية.
  2. قم بتسمية مسبار الحمض النووي إنزيميا باستخدام α-32P dCTP المشع وتنقيته باستخدام مجموعات متوفرة تجاريا وفقا لتوصية الشركة المصنعة.
    ملاحظه: نستخدم مسبارا يبلغ طوله 0.5-2.0 كيلو بايت من منطقة محفز محسن أو تسلسل ترميز البروتين في الجينوم الفيروسي. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم 32مجسا مشعا مسمى P للكشف عن الإشارة ، يمكن أيضا استخدام مجسات كيميائية أو فلورية غير مشعة (يرجى الرجوع إلى قسم المناقشة).
  3. ضع الغشاء في زجاجة تهجين مع الجانب المرتبط بالحمض النووي لأعلى ، واشطف الغشاء باستخدام 5 مل من محلول التهجين الدافئ مسبقا ، وتخلص من المخزن المؤقت. ثم أضف 10 مل من محلول التهجين المسخن مسبقا وضع الزجاجة في فرن تهجين دوار على درجة حرارة 65 درجة مئوية≥.
  4. تشوه الحرارة 20 ميكرولتر من 10 مجم / مل من محلول الحمض النووي للحيوانات المنوية أو سمك السلمون المنفصم والمسبار المسمى 32P (≥107 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق عن طريق وضع الأنابيب على كتلة حرارية مثبتة عند 100 درجة مئوية. ثم قم بتبريدها على الثلج لمدة ≥2 دقيقة ، ثم قم بتدويرها لفترة وجيزة ، واحتفظ بها على الثلج حتى يتم استخدامها.
    أنذر: بالنسبة لمجسات الحمض النووي المشعة ، يجب استخدام أنابيب 1.5 مل مع أغطية لولبية وحلقات O.
  5. أضف الحمض النووي للحيوانات المنوية المشوهة والمسبار المشع بسرعة إلى مخزن التهجين في زجاجة التهجين ورج الزجاجة لمدة 10 ثوان لخلطها. أعد الزجاجة إلى الفرن 65 درجة مئوية واحتضن الزجاجة مع الدوران عند 65 درجة مئوية لمدة ≥4 ساعات.
  6. بمجرد اكتمال التهجين ، أوقف الدوران ، وقم بإزالة زجاجة التهجين ، ثم صب محلول المسبار المشع في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع غطاء مانع للتسرب من السدادة. قم بتخزين المسبار في وعاء مناسب يوضع في ثلاجة مخصصة للمواد المشعة.
    ملاحظه: يمكن إعادة استخدام عازلة التهجين المستخدمة مع مسبار يتم تخزينه عند 4 درجات مئوية 5 مرات على الأقل عن طريق وضع الأنبوب المخروطي سعة 50 مل مع غطاء مانع للتسرب يحتوي على عازلة تهجين في حمام مائي 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. اغسل الغشاء باستخدام Wash Buffer المسخن إلى 65 درجة مئوية. أضف 20 إلى 30 مل من Wash Buffer إلى زجاجة التهجين وقم بتدويرها لمدة 5 دقائق. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    ملاحظه: قياس النشاط الإشعاعي لمحاليل الغسيل وتسجيله إذا طلب ذلك المعهد المحلي.
  8. أثناء غسل الغشاء ، ضع شاشة تصوير فوسفور على ممحاة الصور لمدة 5 دقائق.
  9. بعد الغسيل الثالث ، قم بإزالة الغشاء من زجاجة التهجين ، وقم بإزالة المخزن المؤقت الزائد على الغشاء باستخدام مناشف ورقية ، وضع الغشاء في حامل ورق بلاستيكي شفاف. تحقق من الإشارات المشعة على الغشاء باستخدام عداد جيجر. قم بتعريض شاشة التصوير الفوسفوري المحذوفة للغشاء لمدة 10 دقائق إلى ليلة وضحاها ، اعتمادا على شدة الإشارة.
  10. امسح الشاشة ضوئيا باستخدام نظام مسح الصور الفوسفورية واحصل على البيانات المتعلقة بكثافة الإشارة لكل نقطة.
< p class = "jove_content" > الجدول 1: معايير الحمض النووي البلازميد الكمية لطخة نقطية. يتم عرض الأحجام اللازمة من محلول الحمض النووي البلازميد القياسي 25 بيكوغرام / ميكرولتر والماء أو TE لإعداد معايير الحمض النووي البلازميد عن طريق التخفيفات التسلسلية ذات الضعفين (600 ميكرولتر / أنبوب). الأرقام الموجودة في العمود القياسي للحمض النووي البلازميد (0.039 إلى 5 نانوغرام) هي كمية الحمض النووي في 200 ميكرولتر من كل محلول قياسي للحمض النووي البلازميد.

معيار الحمض النووي البلازميد (ng) أحجام (ميكرولتر) من محلول قياسي للحمض النووي البلازميد 25 بيكوغرام / ميكرولتر أحجام (ميكرولتر) من الماء الحجم الكلي (ميكرولتر) 5 600 دولار 0 600 دولار 2.5 300 ريال 300 ريال 600 دولار 1.25 150 حيا 450 ريال 600 دولار 0.625 75 525 600 دولار 0.313 37.5 دولار 562.5 600 دولار 0.156 18.8 دولار 581.2 دولار 600 دولار 0.078 9.4 590.6 دولار 600 دولار 0.039 4.7 595.3 [إ] 600 دولار

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات بنزوناز MilliporeSigma 1016970001 يشار إليه باسم نوكلياز داخلي Serratia marcescen في النص الرئيسي. DNase I روش 4716728001 يشار إليه باسم DNase I Enzyme A في النص الرئيسي. DNase I إنفيتروجين 18047019 يشار إليه باسم DNase I Enzyme B في النص الرئيسي. DNase I نيو إنجلاند بيولابيس M0303L يشار إليه باسم DNase I Enzyme C في النص الرئيسي. 1.5 مل مرفقة O-Ring برغي كاب أنابيب الطرد المركزي الدقيقة كورنينج 430909 15 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبلين كورنينج 352097 3 م أسيتات الصوديوم تكنوفا S0298 50 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبلين كورنينج 430291 AccuGENE 0.5 M EDTA حل لونزا 51234 أكيوجين 1 م تريس حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 8.0 لونزا 51238 AccuGENE 10٪ SDS لونزا 51213 AccuGENE 1X TE Buffer لونزا 51235 جهاز النقاط الحيوية بيو راد 1706545 ألبومين مصل الأبقار MilliporeSigma أ 3294 رافع الخلية كورنينج 3008 كلوروفورم MilliporeSigma 372978 طقم مستخرج الحمض النووي واكو للصناعات الكيماوية النقية 295-50201 يستخدم هذا لبقع النقاط الكمية على الفيروس المنقى. نستخدم نصف حجم جميع الكواشف فقط في كل خطوة موصى بها لمخطط البروتوكول 2 في الدليل المقدم من الشركة المصنعة. دليل على الإيثانول 200 مختبرات ديكون 2716 فيكول 400 ألفا إيسار ب 22095 يشار إليه باسم Polysucrose 400. الجليكوجين روش 10901393001 الرنجة المنوية الحمض النووي إنفيتروجين 15634-017 أنابيب التهجين ثيرمو فيشر العلمي 13-247-150 إيمج كوانت تي إل جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة إيمج كوانت تي إل المغنيسيوم كولوريد سداسي هيدرات MilliporeSigma M0250 كاسيت التعرض للفوسفور جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة مختلف شاشة التصوير الفوسفوري جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة مختلف طقم البلازميد ماكسي كياجين هاتف: 12162 بولي إيثيلينيمين شركة Polysciences Inc 23966-2 بولي فينيل بيروليدون MilliporeSigma ص 5288 محلول البروتيناز K إنفيتروجين هاتف: 25530-049 إنزيمات التقييد نيو إنجلاند بيولابيس مختلف الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون إنفيتروجين 15632011 الماصات المصلية ثيرمو فيشر العلمي 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 كلوريد الصوديوم ثيرمو فيشر العلمي س271-10 سترات الصوديوم ثنائي الهيدرات ثلاثية القواعد MilliporeSigma [ك8532] [ك] قاعدة تريس ثيرمو فيشر العلمي بي ت 152-5 إعصار FLA 7000 جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة 28955809 الفينول المشبع بالمخزن المؤقت فائق النقاء إنفيتروجين هاتف: 15513-047 الأشعة فوق البنفسجية Crosslinker الطيف الطيفي XLE-1000 يتم استخدام وضع الارتباط المتقاطع الأمثل ، مما يوفر جرعة طاقة للأشعة فوق البنفسجية تبلغ 120 مللي جول / سم 2. غشاء Zeta-Probe بيو راد 162-0165

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة