لطخة النقطة الكمية لتقدير البروتينات المستهدفة في محللة الأنسجة

الملخص

المصدر: Qi, X., et al. إنتاجية عالية ، تحديد مطلق لمحتوى بروتين محدد على مستويات الأنسجة باستخدام تحليل لطخة النقطة الكمي (QDB). J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية لطخة نقطية كمية ، أو QDB ، للقياس الكمي المطلق للبروتينات ذات الأهمية في عينة الأنسجة. يتم تثبيت البروتينات الموجودة في العينة على غشاء النيتروسليلوز داخل آبار صفيحة QDB. باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين المستهدف المسمى بإنزيم البيروكسيديز ، تتأكسد الركيزة الكيميائية المضيئة لإنتاج الضوء ، والذي يتم قياسه لتحديد تركيز البروتين في العينة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير العينة

1. خذ 50 مجم من أنسجة الفئران في أنبوب سعة 1.5 مل. أضف 200 ميكرولتر من محلول التحلل (50 ملي مولار HEPES ، درجة الحموضة 7.4 ، 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار EDTA ، 5 ملي EGTA ، 1 ملي ملي كلوريد₂ ، 10 ملي Na₂P₂O₇ ، 1٪ تريتون X-100 ، 10٪ جلسرين) ، مكملا بمثبطات البروتياز والفوسفاتيز (100 ملي مولار NaF ، 0.1 ملي مولار فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد ، 5 ميكروغرام / مل بيبستاتين ، 10 ميكروغرام / مل ليوبيبتين ، 5 ميكروغرام / مل من البروتينين).
2. تجانس الأنسجة باستخدام الخالط لمدة 1 دقيقة على الجليد.
3. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 8,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
4. اجمع المادة الطافية في أنابيب جديدة (1.5 مل) وأخرج 1 ميكرولتر لفحص تركيز البروتين باستخدام مجموعة BCA.
   ملاحظة: يمكن استخدام جميع مخازن التحلل شائعة الاستخدام لتحليل اللطخة الغربية وتحليل لطخة النقطة لتحليل QDB.

< p class = "jove_title" >2. تحديد خصوصية الجسم المضاد

1. تحضير عينة محللة (20 ميكروجرام) في القسم 1.4 ، BSA الخالي من IgG (20 ميكروغرام) ، والبروتين القياسي (600 بيكوغرام) ، لتحليل اللطخة الغربية.
   ملاحظة: يتم استخدام BSA الخالي من IgG كعنصر تحكم سلبي ويستخدم البروتين القياسي كعنصر تحكم إيجابي. يتم إثبات خصوصية الجسم المضاد من خلال إظهار شريط واحد بالحجم المناسب باستخدام تحليل اللطخة الغربية.

3. تحديد النطاق الخطي لتحليل QDB

1. قم بإذابة البروتين القياسي مع ddH₂O. خفف البروتين إلى تركيز 1,200 بيكوغرام / ميكرولتر.
2. تمييع البروتين المركز من العينات المحضرة في القسم 1.4 إلى 4 ميكروغرام / ميكرولتر.
3. قم بإذابة BSA مع ddH₂O. خفف البروتين إلى تركيز 1,200 بيكوغرام / ميكرولتر و 4 ميكروغرام / ميكرولتر.
4. تم إعداد سلسلة من التخفيفات من البروتين القياسي والعينات المحضرة بتوجيه من الجدول 1 والجدول 2.
5. امزج 10 ميكرولتر من البروتين القياسي المخفف أو العينات المحضرة بالتخفيف و 10 ميكرولتر 2x مخزن مؤقت للتحميل (120 ملي مولار Tris-HCl درجة الحموضة 6.8 ، 20٪ جلسرين ، 4٪ SDS ، 0.2٪ برومفينول أزرق ، 200 ملي DTT) معا.
6. سخني الخلطات على حرارة 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

4. عملية تحليل بنك قطر للتنمية

1. نموذج التطبيق
   1. ادعم لوحة QDB لتجنب ملامسة الجزء السفلي من اللوحة لسطح الطاولة. على سبيل المثال، استخدم صندوق طرف ماصة فارغ كدعم.
   2. قم بتحميل ما يصل إلى 2 ميكرولتر من العينة إلى مركز الغشاء في الجزء السفلي من الوحدة الفردية للوحة QDB.
2. تجفيف اللوحة
   1. اترك لوحة QDB المحملة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو كبديل ، اترك اللوحة المحملة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في مكان جيد التهوية.
3. حجب اللوحة
   1. اغمس لوحة QDB في مخزن النقل المؤقت (0.039 M Glycine ، 0.048 M Tris ، 0.37٪ SDS ، 20٪ كحول ميثيل) ورج الطبق برفق لمدة 10 ثوان.
   2. اشطف طبق QDB برفق باستخدام TBST (محلول ملحي مخزن مؤقت ثلاثي ، 0.1٪ توين 20) ثلاث مرات ، ثم اغسل الطبق لمدة 5 دقائق في TBST تحت الرج المستمر.
   3. قم بسد لوحة QDB بمحلول مانع (5٪ حليب خالي الدسم في TBST (100 ميكرولتر / بئر) لمدة ساعة واحدة تحت الاهتزاز المستمر.
4. حضانة الأجسام المضادة الأولية
   قم
   1. بتخفيف الجسم المضاد الأساسي في المخزن المؤقت المانع بتركيز مختار (من 1: 500 إلى 1: 5,000) ، وأضف 100 ميكرولتر إلى كل بئر فردي من صفيحة عادية مكونة من 96 بئرا. أدخل لوحة QDB في اللوحة المكونة من 96 بئرا ، واحتضن الألواح المدمجة إما لمدة ساعتين عند RT أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية تحت الاهتزاز المستمر.
   2. بدلا من ذلك ، ضع لوحة QDB داخل صندوق ، واملأ الصندوق بمخزن مؤقت مانع من 2 إلى 3 مم فوق الجزء الغشائي من اللوحة إذا تم استخدام نفس الجسم المضاد للوحة بأكملها. أضف الجسم المضاد الأساسي بالتركيز المختار ، واحتضن اللوحة إما لمدة ساعتين في RT أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية تحت الاهتزاز المستمر.
   3. اشطف الطبق برفق باستخدام TBST ثلاث مرات قبل غسله ب TBST ثلاث مرات ، كل مرة لمدة 5 دقائق تحت الرج المستمر.
5. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
   1. قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي في المخزن المؤقت للحجب بالتركيز المختار (من 1: 1,000 إلى 1: 50,000) ، وإما أن يقتبس 100 ميكرولتر / بئر في صفيحة 96 بئرا أو في صندوق كما هو موضح في القسم 4.4.2 ثم احتضان لوحة QDB داخل اللوحة المحملة 96 بئرا أو الصندوق لمدة 1 ساعة عند RT تحت الاهتزاز المستمر.
   2. اشطف طبق QDB برفق 3 مرات باستخدام TBST ، ثم اغسل الطبق 3 مرات ، 5 دقائق لكل منهما باستخدام TBST تحت الاهتزاز المستمر.
6. التحديد الكمي
   1. قم بإعداد ركيزة التلألؤ الكيميائي المحسنة (ECL) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
   2. Aliquot ركيزة ECL في صفيحة 96 بئرا (100 ميكرولتر / بئر) وأدخل لوحة QDB داخل لوحة 96 بئرا لمدة دقيقتين تحت اهتزاز مستمر.
   3. قم بإزالة لوحة QDB من اللوحة المكونة من 96 بئرا ورجها لفترة وجيزة لإزالة السائل الزائد. ضع الطبق على طبق ميكروتيتر أبيض.
   4. قم بتشغيل قارئ اللوحة الدقيقة ، وحدد "لوحة مع غطاء" على واجهة المستخدم قبل وضع اللوحات المدمجة (لوحة QDB + محول اللوحة البيضاء) داخل قارئ اللوحة الدقيقة للقياس الكمي.
      ملاحظة: تأكد من استخدام لوحة الميكروتيتر البيضاء غير الشفافة كمحول لتجنب أي تداخل من اللوحة. تأكد من اختيار "لوحة مع غطاء" لتجنب تشويش الماكينة عند وضع الألواح المدمجة (لوحة QDB + محول لوحة 96 بئر) داخل قارئ الصفيحة الدقيقة.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. مخطط التخفيف لمنحنى البروتين القياسي.

S1
(0 بكسل / ميكرولتر) S2 (33.3 بكسل / ميكرولتر) S3
(100 بكسل / ميكرولتر) S3
(300 بكسل / ميكرولتر) S5
(600 بكسل / ميكرولتر) S6
(1200 بكسل / ميكرولتر) البروتين القياسي (1200 بكسل / ميكرولتر) 0 1.39 4.17 [إ] 12.5 25 50 BSA
خالية من IgG (4 بكسل / ميكرولتر) 50 48.61 دولار 45.83 دولار 37.5 دولار 25 0 مجموع 50 50 50 50 50 50 < p class = "jove_content" > الجدول 2. مخطط التخفيف للعينات المحضرة

X1
(0 ميكروغرام / ميكرولتر) X2
(0.25 ميكروغرام / ميكرولتر) X3
(0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) X4
(1 ميكروغرام / ميكرولتر) X5
(2 ميكروغرام / ميكرولتر) X6
(4 ميكروغرام / ميكرولتر) عينة (4 ميكروغرام / ميكرولتر) 0 3.125 [ا] 6.25 [إ] 12.5 25 50 BSA خال من IgG (4 ميكروغرام / ميكرولتر) 50 46.875 دولار 43.75 دولار 37.5 دولار 25 0 مجموع 50 50 50 50 50 50

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قارئ اللوحة الدقيقة تيكان تيكان إنفينيت 200 برو لوحة QDB يانتاي زيسترن Co.Ltd تتوفر اللوحات عند الطلب لغرض التحقق إما عبر البريد الإلكتروني أو زيارة www.zestern.net. بيروكسيداز AffiniPure الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) (دقيقة X Bov ، Ck ، GT ، GP ، Sy Hms ، Hrs ، Hu ، MS ، Rat ، Shp Sr Prot) جاكسن 711-035-152 الركيزة التلألؤ الكيميائي المحسنة الحراريه 32134 أرنب مضاد ل CAPG شركة Sino Biologic Inc هاتف: 14213-ت52 بروتين CAPG شركة Sino Biologic Inc 14213-HNAE هيبس سيغما إتش 4034 كلوريد الصوديوم تيانجين رويجي جين الخاصة الكيميائية المحدودة 10461220 كلوريد المغنيسيوم 2 تيانجين Zhiyuan الكاشف الكيميائي المحدودة 20120802 EDTA سيغما E9884-500G EGTA سيغما BNN1913 نا₂ف_{2 س 7} اختبار الطب الصيني هايتو 20160914 تريتون X-100 سيغما تي 9284 الجلسرين سيغما جي 7757 فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل سيغما P7626-5G الببستاتين سيغما Z290033 ليوببتين سيغما L2884 أبروتينين سيغما أ 3428 تريس حمض الهيدروكلوريك سيغما تي 6455 الحزب الديمقراطي الصربي سيغما L5750-500 جرام DTT سيغما 43815-1 جرام برومفينول أزرق سيغما ب -0126 NaF سيغما S7920