النشاف الغربي الكمي لتقدير مستويات التعبير عن البروتين

الملخص

المصدر: هوانغ ، واي تي ، وآخرون. مقارنة قوية لمستويات البروتين عبر الأنسجة وطوال فترة التطوير باستخدام النشاف الغربي الكمي الموحد. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح الفيديو تقنية نشاف غربية قائمة على تطبيع البروتين بالكامل لتحديد تعبير البروتين المستهدف في العينة. من خلال استخدام تلطيخ البروتين الكلي للعينة ، يتم إجراء تحليل نسبي لتحديد مستوى التعبير النسبي للبروتين المستهدف.

البروتوكول

ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول باستخدام مجموعات وكواشف موحدة ومتاحة تجاريا من أجل زيادة قابلية التكرار (انظر جدول المواد).

< p class = "jove_title" >1. تحضير العينات

1. استخراج البروتين
   1. انقل عينات الخلايا أو الأنسجة المجمدة من -80 درجة مئوية على الثلج الجاف ، وقم بإذابة الثلج ، وغسلها حسب الحاجة باستخدام محلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات (PBS). تجنب دورات التجميد والذوبان غير الضرورية لأن ذلك سيؤثر على جودة البروتين.
   2. أضف المخزن المؤقت لمقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA) (25 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.6) ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1٪ NP-40 ، 1٪ ديوكسيكولات الصوديوم ، 0.1٪ SDS) يحتوي على 1x مثبط البروتياز لكل عينة ، باستخدام الكمية المثلى لكل وزن الأنسجة.
      ملاحظه: اعتمادا على التطبيق ، قد يحتاج نوع ومقدار المخزن المؤقت للتجانس إلى مزيد من التحسين.
   3. استخدم الخالط الكهربائي المحمول باليد مع مدقة البولي بروبلين لتجانس عينات الأنسجة. بين كل عينة ، اغسل المدقة بالماء المقطر المزدوج وجففها بمنديل نظيف. قم بتغيير المدقة بين الظروف والأنسجة التجريبية المختلفة.
   4. اترك العينات على الجليد لمدة 10 دقائق بعد التجانس. الطرد المركزي للعينات عند >10,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
   5. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد على الجليد دون إزعاج الحبيبات. المادة الطافية هي عينة البروتين. قم بتخزين البروتين المستخرج عند -80 درجة مئوية أو تابع مباشرة لقياس تركيز البروتين.
2. القياس الكمي وتطبيع تركيز البروتين
   1. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض البيسنشونيك (BCA). قم بإعداد مزيج فحص BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في لوحة بصرية 96 بئرا باستخدام 200 ميكرولتر من مزيج BCA لكل بئر.
      ملاحظه: يمكن أيضا استخدام طرق القياس الكمي الأخرى مثل فحوصات لوري وبرادفورد لتحديد تركيز البروتين طالما يتم قياس تركيز البروتين باستمرار عبر التجارب.
   2. قم بإعداد معايير ألبومين مصل الأبقار (BSA) بتركيزات متزايدة في ثلاث نسخ وأضف 1 ميكرولتر من كل عينة بروتين في نسختين. احتضان اللوحة المكونة من 96 بئرا في كتلة حرارية مسخنة مسبقا عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو أكثر إذا كان من المتوقع أن يكون تركيز البروتين منخفضا.
   3. بعد الحضانة ، قم بقياس الامتصاص عند 560 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
   4. قم بتصدير قياسات قارئ اللوحة وحساب تركيز البروتين من خلال مقارنة متوسط قيم الامتصاص لكل عينة بمنحنى قياسي تم الحصول عليه باستخدام معيار البروتين. يجب أن تكون قيمة تربيع R للمنحنى القياسي أكبر من أو تساوي 0.98 لتقدير تركيز بروتين العينة بدقة.
   5. تطبيع كمية البروتين عن طريق تحضير تخفيفات عينات البروتين في عازلة العينة والمياه فائقة النقاء. يمكن تعديل الحجم الكلي حسب نوع الجل المستخدم. يوصى بتحميل 30 ميكروغرام من البروتين لكل حارة ككمية مبدئية. أضف عامل اختزال مثل dithiothreitol (DTT ؛ التركيز النهائي 5 مليمتر) أو بيتا ميركابتو إيثانول (التركيز النهائي 200 مليمتر) لكل عينة حسب الحاجة. ماصة بيتا ميركابتو إيثانول غير مخففة في غطاء الدخان.
   6. احتضان العينات في كتلة حرارية عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ضع العينات على الجليد ، والدوامة ، وقم بتدويرها لفترة وجيزة لجمعها. استمر في وضع الثلج حتى تحميل الجل.

< p class = "jove_title" >2. الرحلان الكهربائي للهلام لعينات البروتين

1. إعداد الجهاز والهلام
   1. قم بإعداد جل متدرج مسبق الصب بنسبة 4-12٪ Bis-Tris (انظر جدول المواد) في نظام غرفة الرحلان الكهربائي للهلام. اشطف المواد الهلامية بالماء المقطر المزدوج قبل الاستخدام.
      ملاحظة: اعتمادا على حجم البروتين محل الاهتمام وتفاعلاته ووفرة منه ، يمكن استخدام المواد الهلامية ذات التدرج المختلف أو عامل التخزين المؤقت أو حجم البئر وعدده.
   2. أضف 500 مل من 1x MES SDS قيد التشغيل المخزن المؤقت المخفف في الماء المقطر المزدوج لكل خزان. قم بإزالة المشط بعناية من المواد الهلامية بعد إضافة المخزن المؤقت الجاري دون إزعاج الآبار في جل التكديس.
2. تحميل البروتين
   1. قم بتحميل 3.5 ميكرولتر من معيار البروتين في البئر. اعتمادا على تخطيط العينة ، يمكن أن يساعد تحميل سلم البروتين على جانبي الجل في تقدير حجم البروتين بدقة أكبر. استخدم أطراف تحميل الجل ذات الرؤوس الدقيقة لتحميل العينات بشكل أكثر دقة.
   2. عند استخدام معيار داخلي للتطبيع بين الأغشية (انظر الخطوة 5 أدناه والمناقشة) ، قم بتحميل كمية تساوي العينات الأخرى في أول 3 آبار بجوار سلم البروتين.
   3. قم بتحميل 30 ميكروغرام من كل عينة في الآبار المتبقية. أضف 1x عينة عازلة إلى جميع الآبار الفارغة.
3. الرحلان الكهربائي
   1. قم بتجميع خزان الجل بعد تحميل العينات. قم بتشغيل العينات من خلال جل التكديس عند 80 فولت لمدة 10 دقائق متبوعا ب 150 فولت لمدة 45-60 دقيقة إضافية.

< p class = "jove_title" >3. نقل البروتين

ملاحظة: يتم نقل البروتين في هذا البروتوكول باستخدام نظام نشاف شبه جاف متاح تجاريا (انظر جدول المواد) للحصول على نتائج سريعة ومتسقة.

1. قم بإعداد نقل البروتين عن طريق نقع ورق الترشيح مسبقا في الماء المقطر المزدوج والتأكد من أن سكين الجل وماصة باستور البلاستيكية وأسطوانة النشاف والملقط جاهزة للاستخدام.
2. افتح كومة النقل عن طريق إزالة جميع رقائق التغليف بعناية. قم بإزالة الجزء العلوي من المكدس السفلي وضعه جانبا. بلل الغشاء بسرعة على المكدس السفلي بعدة قطرات من المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي (2-3 مل). بمجرد فتح مكدس النقل ، من المهم منع غشاء PVDF من الجفاف.
3. بعد إيقاف الرحلان الكهربائي ، افتح الجل المصبوب مسبقا باستخدام سكين الجل واقطع جل التكديس. قطع الجل حول حوافه لتحريره من قالب البلاستيك. حافظ على سكين الجل رطبا لمنع تلف الجل.
4. قم بتجميع كومة النقل من الأسفل إلى الأعلى: المكدس السفلي (الذي يحتوي على غشاء PVDF) ، وهلام البروتين ، وورق الترشيح. استخدم أسطوانة النشاف لإزالة جميع فقاعات الهواء. ضع المكدس العلوي أعلى ورق الترشيح وقم بلف المكدس مرة أخرى لإزالة فقاعات الهواء. لا تضغط بقوة كبيرة لأن ذلك قد يتسبب في تشوه الجل أثناء نقل البروتين.
5. انقل المكدس بالكامل إلى جهاز النقل باستخدام القطب الكهربائي الموجود على الجانب الأيسر من الجهاز وضع إسفنجة الجل أعلى المكدس بحيث تتماشى مع جهات الاتصال الكهربائية المقابلة على الجهاز. أغلق الغطاء وحدد البرنامج المناسب وابدأ تشغيله (20 فولت لمدة 7 دقائق هي نقطة البداية الموصى بها).
6. عند الانتهاء ، اترك الغطاء مغلقا لمدة دقيقتين للسماح للكومة بالتبريد ومنع الغشاء من الجفاف. قم بإزالة كومة النقل وقطع الغشاء إلى حجم الجل. اغسل الغشاء المقطوع بسرعة بالماء المقطر المزدوج قبل الاستمرار في بقعة البروتين الكاملة.

< ص الفئة = "jove_title" >4. تلطيخ البروتين الكلي

ملاحظة: يوفر استخدام الكشف عن الفلورسنت فائدة كبيرة على الأساليب الأكثر تقليدية (على سبيل المثال ، اكتشاف ECL) ، حيث يمكن التحكم في النطاق الخطي والحساسية بشكل أفضل. لذلك ، في الخطوتين 4 و 5 ، يتم استخدام TPS الفلورية والأجسام المضادة الثانوية الفلورية (انظر جدول المواد).

1. قم بلف الغشاء في أنبوب سعة 50 مل بحيث يكون جانب البروتين متجها للداخل. بسبب حساسية الضوء ل TPS الفلوري والأجسام المضادة الثانوية ، يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في الظلام.
2. أضف 5 مل من محلول بقع البروتين (انظر جدول المواد) واحتضنه على الأسطوانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نظرا لأن TPS ومخزن الغسيل المؤقتة يحتويان على الميثانول ، فقم بتنفيذ هذه الخطوات في غطاء الدخان.
3. تخلص من محلول التلوين واغسله مرتين بسرعة باستخدام 5 مل من محلول الغسيل (6.3٪ حمض الأسيتيك في 30٪ ميثانول). ضع الأنبوب لفترة وجيزة مرة أخرى على الأسطوانة بين خطوات الغسيل. اشطف الغشاء لفترة وجيزة بالماء فائق النقاء قبل المتابعة.

< p class = "jove_title" >5. الحجب وحضانة الأجسام المضادة والكشف

عنها

1. سد الغشاء: أضف 3 مل من المخزن المؤقت للحجب (انظر جدول المواد) إلى أنبوب 50 مل الذي يحتوي على الغشاء. احتضان الغشاء على الأسطوانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اعتمادا على اختيار الجسم المضاد ، قد يتطلب نوع المخزن المؤقت للحجب المستخدم تحسينا.
2. حضانة الأجسام المضادة الأولية
   1. تخلص من المخزن المؤقت للحجب واستبدله بالجسم المضاد الأساسي بالتركيز المناسب والمحسن (الشكل 1 والشكل 2: الفأر المضاد ل SMN ، عند 1: 1,000 ، مخفف في المخزن المؤقت الحظر).
      ملاحظه: يجب أن يتضمن التحسين الكافي للأجسام المضادة الأولية تأكيدا على أن الجسم المضاد يكتشف منتجا بروتينا بالحجم الصحيح بينما لا يظهر أي ارتباط أو الحد الأدنى من الارتباط بمنتجات بروتينية أخرى غير محددة. إذا أمكن ، اختبر وقارن الأجسام المضادة المتعددة بالبروتين المعني.
   2. احتضان الغشاء على الأسطوانة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد واغسله 6 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام 1x PBS على أسطوانة في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
   1. قم بإعداد الجسم المضاد الثانوي المحدد عند 1: 5,000 ضد مضيف الجسم المضاد الأساسي في مخزن مانع 5 مل. قد تتطلب الأجسام المضادة الثانوية الأخرى تخفيفات أخرى أو استخدام مخازن حادة بديلة.
   2. احتضان الغشاء بمحلول الجسم المضاد الثانوي على الأسطوانة لمدة 1 ساعة في RT. بعد الحضانة ، اغسل الغشاء ثلاث مرات 30 دقيقة باستخدام 1x PBS على الأسطوانة.
   3. جفف الغشاء وحافظ على الغشاء محميا من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم حتى اكتشافه. يمكن الاحتفاظ بالأغشية عند 4 درجات مئوية للتخزين طويل الأجل.
4. الحصول على الصور
   1. قم بتسجيل الدخول إلى الكمبيوتر المتصل بالماسحة الضوئية. ضع الغشاء على الماسح الضوئي بحيث يكون جانب البروتين متجها لأسفل وحدد منطقة المسح الضوئي في البرنامج.
   2. قم بتحسين شدة الليزر لكل من القناتين (700 نانومتر و 800 نانومتر) ، من خلال التأكد من عدم حدوث أي تشبع. احصل على الصور في كلتا القناتين وقم بتصدير الصور لمزيد من التحليل (الخطوة 6).

< p class = "jove_title" >6. تحليل اللطخة الغربية والقياس الكمي

ملاحظة: تستند هذه التوصيات إلى برنامج Image Studio المتاح مجانا. ومع ذلك ، يمكن أيضا إجراء تحليلات قابلة للمقارنة باستخدام حزم برامج أخرى ، مثل ImageJ.

1. استيراد الملف: قم بإنشاء مساحة عمل محلية على الكمبيوتر المستخدم للتحليل. يؤدي هذا إلى إنشاء قاعدة بيانات لملفات الصور للبقع الغربية المكتسبة. قم باستيراد الملفات التي تم الحصول عليها على الماسح الضوئي وحدد الصورة لتحليلها.
2. تحليل TPS
   1. اعرض قناة 700 نانومتر لإظهار نتيجة تلطيخ البروتين الإجمالية. يتم تضمين مثال على صورة TPS في الشكل 1 حيث تتم مقارنة الأنسجة المختلفة من حديثي الولادة (P5) (الشكل 1A-B) والفئران البالغة من العمر 10 أسابيع (الشكل 1C-D) مباشرة. وبالمثل ، يوضح الشكل 2 مثالا على مقارنة مباشرة لأنسجة المخ من الفئران من مختلف الأعمار.
   2. حدد علامة التبويب تحليل من الزاوية اليمنى العليا وحدد إضافة مستطيل لتحديد منطقة الاهتمام للتسوية (الشكل 1 ب ، د). انسخ ولصق منطقة المستطيل الأولى على كل عينة على حدة للتأكد من أن المنطقة المحددة بنفس الحجم لجميع الممرات التي تم تحليلها.
   3. انسخ النتيجة من علامة التبويب الأشكال في الزاوية اليسرى السفلية من البرنامج.
3. القياس الكمي
   ملاحظه: يعتمد النهج الأمثل لقياس العينات على التصميم التجريبي. سنقدم هنا مثالا توضيحيا للكشف عن بروتين الخلايا العصبية الحركية للبقاء على قيد الحياة (Smn ؛ وهو بروتين رئيسي يشارك في مرض الضمور العضلي الشوكي العصبي العضلي) ، والذي من المعروف أنه ينخفض بمرور الوقت ، وكيف يوفر تطبيع شدة إشارة Smn إلى TPS تقديرات موثوقة لتطور تعبير البروتين.
   1. يوضح الشكل 2 انخفاضا في تعبير Smn مع زيادة عمر المصاب ب TPS كعنصر تحكم في تحميل البروتين. كرر الخطوات 6.2.1-6.2.3 لتحديد تحميل البروتين (الشكل 2 ب). كرر الخطوات 6.2.1-6.2.3 في قناة 800 نانومتر (الشكل 2 أ) لتحليل البروتين محل الاهتمام.
   2. انسخ النتائج من كل من TPS والبروتين ذي الأهمية إلى برنامج جداول البيانات. في جدول البيانات ، أولا ، قم بتطبيع تحميل البروتين عن طريق تحديد أعلى إشارة TPS وقسمة كل قيمة إشارة TPS على هذه القيمة للحصول على قيمة تحميل البروتين الطبيعية.
   3. اقسم قيمة إشارة 800 نانومتر من كل عينة فردية على قيمة البروتين الطبيعي المقابلة لها لحساب نسبة التعبير النسبي للبروتين في عينات مختلفة.
   4. بعد التطبيع الأول ، قارن النقاط الزمنية أو الأنسجة المختلفة بمتوسط قيمة المعيار الداخلي للسماح بإجراء مقارنات مباشرة عبر الأغشية والتجارب المختلفة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تظهر البقع الغربية مستويات بروتين TPS و Smn في أنسجة الفئران في عمرين مختلفين.بروتين TPS و Smn للفئران P5 (A) و 10 أسابيع (C). (ب ، د) تم حساب شدة التألق ل TPS للممر الكامل ويشار إليها (بوحدات تعسفية). م: معيار علامة / بروتين. كيلو دالتون: كيلودالتون. A.U.: وحدة تعسفية. P5: يوم ما بعد الولادة 5 ؛ 10 واط: 10 أسابيع.

< p cla...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات نصائح تحميل الجل ذات الرؤوس الدقيقة مختبرات ألفا GL20057SNTL كوكتيل مثبط البروتياز ، خال من EDTA 100 × 5 مل ثيرموفيشر العلمي 78437 متجانس محمول باليد مجموعة VWR 431-0100 جهاز نقل جل iBlot 2 ثيرموفيشر العلمي IB21001 مكدس نقل iBlot ، PVDF ، الحجم العادي ثيرموفيشر العلمي IB401031 استوديو الصور لايت ليكور غير متاح تحميل مجاني من https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ الأجسام المضادة الثانوية IRDye 800CW ليكور -- حدد الجسم المضاد الثانوي المناسب المحدد ضد مضيف الجسم المضاد الأولي. مجموعة فحص البروتين Micro BCA ثيرموفيشر العلمي هاتف: 23235 معيار البروتين الملون مسبقا من Novex Sharp ثيرموفيشر العلمي ال سي 5800 NuPAGE 4-12٪ جل بروتين Bis-Tris ، 1.0 مم ، 15 بئر ثيرموفيشر العلمي NP0323BOX عينة المخزن المؤقت ل NuPAGE LDS (4X) ثيرموفيشر العلمي NP0007 NuPAGE MOPS SDS قيد التشغيل المخزن المؤقت (20X) ثيرموفيشر العلمي NP0001 Odyssey حجب المخزن المؤقت ليكور 927-40000 الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر المنقى المضاد ل SMN (الخلايا العصبية الحركية للبقاء على قيد الحياة) مختبرات BD Transduction 610646 يستخدم على نطاق واسع في أدبيات SMN / SMA ويعطي نتائج متسقة بغض النظر عن رقم الدفعة ريفرت صبغة بروتين توتال ، 250 مل ليكور 926-11021 محلول الغسيل REVERT ليكور 926-11012 RIPA تحلل واستخراج المخزن المؤقت ثيرموفيشر العلمي 89900 XCell SureLock خلية صغيرة ثيرموفيشر العلمي EI0001