< p class = "jove_title" >1. تحديد تكوين الخلية في تعليق الخلية باستخدام تحليل اللطخة الغربية أحادية الخلية (scWB)
- أعد ترطيب شريحة scWB قبل الاستخدام في 15 مل من مخزن التعليق 1x في طبق بتري لمدة 10 دقائق على الأقل في RT.
- أضف 1 مل من المعلق أحادي الخلية المخفف (10,000-100,000 خلية / مل) إلى الرقاقة المعاد ترطيبها. ضع السطح في قاع طبق بتري مقاس 10 سم. تأكد من أن السطح مسطح.
- قم بتغطية طبق بتري بغطاء لمنع الجفاف واترك الخلايا تستقر لمدة 5-15 دقيقة بتدرج.
- ضع الشريحة تحت مجهر المجال الساطع وافحص الآبار بتكبير 10x.
ملاحظه: يجب أن تشغل خلية واحدة ما يقرب من 15-20٪ من الآبار الصغيرة ، ويجب أن تحتوي أقل من 2٪ من الآبار على خليتين أو أكثر.
- قم بإمالة طبق بتري مقاس 10 سم الذي يحتوي على الشريحة بمقدار 45 درجة.
- اغسل الرقاقة باستخدام المخزن المؤقت للتعليق 1x لإزالة الخلايا غير الملتقطة من سطح الرقاقة عن طريق سحب العينة برفق من أعلى إلى أسفل الشريحة. كرر 3 مرات.
- تحضير الأداة الغربية أحادية الخلية.
- اضبط وقت التحلل ووقت الرحلان الكهربائي ووقت التقاط الأشعة فوق البنفسجية. لتحليل البلاعم المجندة المستردة من سدادة الهلام المشتقة من الغشاء القاعدي ، استخدم الإعدادات التالية: وقت التحلل: 0 ثانية. وقت الرحلان الكهربائي: 160 ثانية ؛ وقت التقاط الأشعة فوق البنفسجية 240 ثانية.
- قم بتحميل الشريحة بعناية في خلية الرحلان الكهربائي لأداة غربية أحادية الخلية ، تواجه جانب الهلام. توخي الحذر حتى لا تتلف الجانب الهلامي من الشريحة.
- صب المخزن المؤقت للتحلل / التشغيل في الغرفة وقم بتغطية الشريحة الغربية أحادية الخلية بالكامل بالكامل. ابدأ تحلل الخلية.
- قم بتشغيل أداة scWB باستخدام الإعداد المدرج في 1.8.
- بمجرد اكتمال التشغيل ، انقل الشريحة إلى طبق بتري مقاس 10 سم واغسل الشريحة مرتين باستخدام مخزن غسيل 1x لمدة 10 دقائق في RT.
- تحضير تخفيفات الأجسام المضادة الأولية (مضاد الفينكولين: 1:10 ؛ مضاد CD45: 1:15 ، مضاد CD11b: 1:20 ، مضاد F4 / 80: 1:10) بحجم إجمالي قدره 80 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة (امزج 8 ميكرولتر من الجسم المضاد 1 بالإضافة إلى 8 ميكرولتر من الجسم المضاد 2 بالإضافة إلى 64 ميكرولتر من المخفف).
- أضف 80 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الأساسي إلى غرفة فحص الجسم المضاد وقم بخفض جانب هلام الرقاقة لأسفل بحيث يفتيل محلول الجسم المضاد عبر الشريحة.
- احتضان بمحلول الأجسام المضادة الأولية لمدة 2 ساعة في RT.
- اغسل الرقاقة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في 1x الغسيل المؤقت على شاكر.
- اغسل الرقائق مرة واحدة لمدة 10 دقائق في الماء على الخلاط لتحلية الجل.
- قم بإعداد تخفيف 1:20 للجسم المضاد الثانوي بحجم إجمالي قدره 80 ميكرولتر (امزج 2 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي بالإضافة إلى 78 ميكرولتر من المخفف).
- احتضان الرقاقة بجسم مضاد ثانوي لمدة 1 ساعة في RT محمي من الضوء.
- اغسل الشريحة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق باستخدام 1x الغسيل المؤقت على شاكر.
- قم بتدوير الرقاقة باستخدام أداة دوارة منزلقة لإزالة أي مخزن مؤقت متبقي.
- امسح الشريحة على ماسح ضوئي مزدوج الليزر بدقة 5 ميكرومتر عند القناة الطيفية للفلوروفور المقترن بالأجسام المضادة الثانوية.
- تحليل البيانات باستخدام برنامج خاص ب scWB.
< p class = "jove_title" >2. تجريد شريحة scWB
- قم بتخزين الشريحة الممسوحة ضوئيا في مخزن مؤقت للغسيل حتى تصبح جاهزة للتجريد.
- ضع الحمام المائي في غطاء الدخان.
- ضع رفا أنبوبيا سعة 50 مل في الحمام المائي مع الماء على ارتفاع 1 سم فقط فوق الرف واضبط درجة حرارة الماء على 60 درجة مئوية.
- تحضير المخزن المؤقت للتجريد. للحصول على 1 لتر من محلول التجريد العازل ، قم بإذابة 9.85 جم من Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8) و 20 جم من SDS في 900 مل من الماء المقطر واضبط الرقم الهيدروجيني. ثم املأ بالماء المقطر إلى 1 لتر. أضف 0.8٪ (حجم حجم / حجم) من β-mercaptoethanol (β-ME ؛ 14.3 M) مباشرة قبل كل استخدام.
- بعد الفحص الأولي ، ضع الشريحة في طبق بتري مقاس 10 سم قبل تجريده.
- لكل شريحة ، خذ 40 مل من المخزن المؤقت للتجريد وأضف 320 ميكرولتر من β-ME.
تنبيه: β-ME سام وخطير على الإنسان والبيئة. يجب أن يتم الإجراء التالي في غطاء الدخان.
- ضع الشريحة في العلبة وأغلق العلبة بالبارافيلم لمنع تسرب الماء إلى العلبة
- ضع العلبة داخل رف الأنبوب في الحمام المائي الدافئ مسبقا.
- احتضن لمدة 90 دقيقة.
- قم بإزالة الشريحة بحذر من العلبة وضعها في طبق بتري طازج.
- اغسل الشريحة لفترة وجيزة مرة واحدة باستخدام 1x غسيل عازلة. ثم أضف 15 مل من مخزن الغسيل 1x إلى طبق بتري.
- اغسل الشريحة لمدة 15 دقيقة على شاكر. كرر خطوة الغسيل أربع مرات.
ملاحظه: Chip جاهز للجسم المضاد الأساسي التالي (انظر الخطوات 1.12 - 1.21)
