فحص اللطخة الغربية المضيئة الكيميائية لمعالجة البروتين

الملخص

المصدر: Hillert-Richter ، L. K. et al. ، قياس تكوين مركب الإشارات المحفز للموت CD95 ومعالجة Procaspase-8 في هذا المجمع. J. Vis. Exp. (2021).

يصف هذا الفيديو النشاف الغربي القائم على التلألؤ الكيميائي للمحللات المناعية المرسبة. تساعد هذه التقنية في تحديد معالجة البروتين وتنشيطه. تتناسب الإشارة الكيميائية المكتشفة مع مستوى معالجة البروتين أثناء تنشيطه.

البروتوكول

تم إجراء تجارب الخلايا التائية

وفقا للاتفاقية الأخلاقية 42502-2-1273 Uni MD.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الخلايا للتجربة

ملاحظة: متوسط عدد الخلايا لهذا الترسيب المناعي هو 1 × 10⁷. يجب زرع الخلايا الملتصقة قبل يوم واحد من التجربة بحيث يكون هناك 1 × 10 7 خلايا في يوم التجربة.

1. تحضير الخلايا الملتصقة للتجربة
   1. البذور 5-8 × 10⁶ خلايا ملتصقة في 20 مل من الوسط (انظر جدول المواد لمعرفة التركيبة) لكل حالة في أطباق 14.5 سم قبل يوم واحد من بدء التجربة.
   2. في يوم التجربة ، تأكد من أن الخلايا ملتقية بنسبة 80-90٪ وتلتزم بالطبق. تخلص من الوسيط وأضف وسيطا جديدا إلى الخلايا الملتصقة.
2. تحضير خلايا التعليق للتجربة
   1. ضع بعناية 1 × 10⁷ خلايا معلقة في 10 مل من وسط الثقافة (انظر جدول المواد لمعرفة التركيبة) لكل حالة في أطباق مقاس 14.5 سم مباشرة قبل بدء التجربة.
   2. في حالة استخدام الخلايا الأولية ، قم بعزل الخلايا التائية الأولية وفقا للإجراء الموضح سابقا. عالج الخلايا التائية الأولية ب 1 ميكروغرام / مل من الهيماجلوتينين النباتي لمدة 24 ساعة ، متبوعا ب 25 وحدة / مل علاج IL2 لمدة 6 أيام.
   3. ضع بعناية 1 × 10⁸ خلايا تائية أولية في 10 مل من وسط الاستزراع (انظر جدول المواد لمعرفة التركيبة) لكل حالة في أطباق مقاس 14.5 سم مباشرة قبل بدء التجربة.
      ملاحظه: يوصى بهذا العدد الأكبر من الخلايا التائية الأولية ، لأن هذه الخلايا أصغر.

فئة

2. تحفيز CD95L

1. تحفيز الخلايا باستخدام CD95L (تم إنتاجه كما هو موضح سابقا أو متاح تجاريا (انظر جدول المواد).
   ملاحظه: يعتمد تركيز CD95L ووقت التحفيز على نوع الخلية. قم بإعداد حالة تحفيز واحدة مرتين لإنشاء عينة "تحكم في الخرزة" بالتوازي.
   1. تحفيز الخلايا الملتصقة بالتركيز المحدد من CD95L. أمسك اللوحة بزاوية وقم بإدخال الترابط في الوسط دون لمس الخلايا الملتصقة.
   2. تحفيز خلايا التعليق باستخدام CD95L عن طريق سحب محلول الترابط في معلق الخلية.

< p class = "jove_title" >3. حصاد الخلايا وتحللها

1. ضع أطباق الخلية على الثلج.
   ملاحظه: لا تتخلص من الوسيط. تطفو الخلايا المحتضرة في الوسط وهي مهمة للتحليل.
2. أضف 10 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات البارد (PBS) إلى تعليق الخلية واكشط الخلايا المرفقة من اللوحة. اجمع معلق الخلية في أنبوب سعة 50 مل.
3. اغسل طبق الخلية ب 10 مل من PBS البارد مرتين وضع محلول الغسيل في نفس الأنبوب سعة 50 مل. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية.
4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من PBS البارد. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
5. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من PBS البارد.
6. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من محلول التحلل (يحتوي على كوكتيل مثبط للبروتينات بنسبة 4٪). احتضنها لمدة 30 دقيقة على الجليد.
7. جهاز الطرد المركزي للمحللة بسرعة قصوى (~ 17,000 × جم) لمدة 15 دقيقة ، 4 درجات مئوية.
8. انقل المادة الطافية (المحللة) إلى أنبوب نظيف. تخلص من الحبيبات. خذ 50 ميكرولتر من المحللة في أنبوب آخر. قم بتحليل تركيز البروتين عن طريق فحص برادفورد وخذ كمية المحللة المقابلة ل 25 ميكروغرام من البروتين في قارورة. أضف مخزن التحميل (انظر جدول المواد للتكوين) إلى القارورة. قم بتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية كعنصر تحكم في المحلل.

< p class = "jove_title" >4. الترسيب المناعي (IP)

1. أضف 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة ل APO-1 و 10 ميكرولتر من حبات سيفاروز البروتين A (المحضرة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة) إلى المحللة. أضف 10 ميكرولتر فقط من الخرزات إلى أنبوب منفصل يحتوي على محللة (عينة محفزة) لإنشاء "تحكم في الخرزة><". ملاحظه: استخدم أطراف الماصة ذات الفتحات العريضة إما عن طريق قص الأطراف أو شراء نصائح خاصة للملكية الفكرية أثناء التعامل مع حبات البروتين A sepharose.
2. احتضان خليط المحللة مع الأجسام المضادة / حبات السيفاروز البروتين A مع الخلط اللطيف بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. الطرد المركزي المحللات بالأجسام المضادة / حبات البروتين A سيفاروز عند 500 × جم لمدة 4 دقائق ، 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 1 مل من PBS البارد إلى الخرز ، وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات على الأقل.
3. تخلص من المادة الطافية. يفضل أن يكون استنشاق الخرزات باستخدام حقنة هاميلتون سعة 50 ميكرولتر.

< ص الفئة = "jove_title" >5. وصمة عار غربية

1. أضف 20 ميكرولتر من مخزن التحميل 4x (انظر جدول المواد لمعرفة التركيبة) إلى الخرز وقم بتسخينه عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
2. قم بتحميل المحللات و IP ومعيار البروتين على هلام 12.5٪ من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) (انظر جدول المواد لتحضير الجل) وقم بتشغيله بجهد ثابت يبلغ 80 فولت.
3. انقل البروتينات من هلام SDS إلى غشاء النيتروسليلوز.
   ملاحظه: هنا ، تم استخدام التقنية شبه الجافة ، المحسنة للبروتينات ذات الأهمية ، للنقل على مدى 12 دقيقة (25 فولت ؛ 2.5 أمبير = ثابت). انقع غشاء النيتروسليلوز واثنين من مكدسات النقل صغيرة الحجم في المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي (انظر جدول المواد للتكوين ، وقم بالتحضير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) لبضع دقائق قبل النشاف الغربي.
4. ضع الغشاء النشاف في صندوق وقم بحجبه لمدة ساعة واحدة في محلول مانع (0.1٪ Tween-20 في PBS (PBST) + 5٪ حليب). احتضان الغشاء بمحلول الحجب تحت التحريض اللطيف.
5. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 5 دقائق لكل غسلة.

< p class = "jove_title" >6. كشف اللطخة الغربية

1. أضف أول جسم مضاد أولي عند التخفيف المشار إليه (انظر جدول المواد) إلى الغشاء واحتضنه طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع تحريك لطيف.
2. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
3. احتضان الغشاء ب 20 مل من الجسم المضاد الثانوي (مخفف 1: 10,000 في PBST + 5٪ حليب) مع رج لطيف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
4. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
5. تخلص من PBST وأضف ما يقرب من 1 مل من ركيزة بيروكسيداز الفجل إلى الغشاء.
6. اكتشف إشارة التلميء الكيميائي (انظر جدول المواد).
   ملاحظه: يعتمد وقت التعرض وعدد الصور الملتقطة على كمية البروتين في الخلية وخصوصية الأجسام المضادة المستخدمة. يجب أن يتم تحديده تجريبيا لكل جسم مضاد يستخدم للكشف.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 12.5٪ جل SDS عصامي لاثنين من المواد الهلامية المنفصلة: 3.28 مل H2O المقطر 2.5 مل تريس ؛ درجة الحموضة 8.8 ؛ 1.5 م 4.06 مل أكريلاميد 100 ميكرولتر 10٪ SDS 100 ميكرولتر 10٪ APS 7.5 ميكرولتر TEMED لاثنين من المواد الهلامية التجميعية: 3.1 مل H2O المقطر 1.25 مل تريس ؛ درجة الحموضة 6.8 ؛ 1.5 م 0.5 مل أكريلاميد 50 ميكرولتر 10٪ SDS 25 ميكرولتر 10٪ APS 7.5 ميكرولتر TEMED أطباق خلية 14.5 سم غرينر 639160 أكريلاميد كارل روث أ 124.1 أطراف ماصة مرشح الهباء الجوي مع مرشح استرداد عالي وفتحة واسعة VWR 46620-664 (أمريكا الشمالية) أو 732-0559 (أوروبا) تستخدم لسحب الخرز إلى المحللة تستخدم لسحب الخرز إلى المحللة سيجما ألدريتش أ 2103 التخفيف: 1: 4000 في PBST + 1: 100 NaN3 مضاد ل APO-1 Ab مقدمة في هذه التجارب من قبل البروفيسور P. Krammer أو يمكن شراؤها بواسطة ENZO ألكس-805-038-C100 تستخدم فقط للترسيب المناعي مضاد للكاسباز -10 أب بيزول MBL-M059-3 التخفيف: 1: 1000 في PBST + 1: 100 NaN3 مضاد للكاسباز -3 أب إشارات الخلية 9662 س التخفيف: 1: 2000 في PBST + 1: 100 NaN3 مضاد للكاسباز -8 أب C15 مقدمة في هذه التجارب من قبل البروفيسور P. Krammer أو يمكن شراؤها بواسطة ENZO ألكس-804-242-C100 التخفيف: 1:20 بوصة PBST + 1:100 NaN3 مضاد ل CD95 Ab سانتا كروز SC-715 التخفيف: 1: 2000 في PBST + 1: 100 NaN3 مضاد ل c-FLIP NF6 Ab مقدمة في هذه التجارب من قبل البروفيسور P. Krammer أو يمكن شراؤها بواسطة ENZO ألكس-804-961-0100 التخفيف: 1:10 في PBST + 1: 100 NaN3 مضاد للفاد 1C4 أب مقدمة في هذه التجارب من قبل البروفيسور P. Krammer أو يمكن شراؤها بواسطة ENZO ADI-AAM-212-E التخفيف: 1:10 في PBST + 1: 100 NaN3 مضاد ل PARP Ab إشارات الخلية 9542 م التخفيف: 1: 1000 في PBST + 1: 100 NaN3 الخطوط الجوية الجزرية كارل روث 9592.3 β ميركابتو إيثانول كارل روث 4227.2 برادفورد محلول بروتين فحص صبغة كاشف الصبغة المركز 450 مل بيو راد 500-0006 تستخدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة سي دي 95 لتر مقدمة في هذه التجارب من قبل البروفيسور P. Krammer أو يمكن شراؤها بواسطة ENZO ألكس-522-020-C005 كاشف التلألؤ الكيميائي Chem Doc XRS + بيو راد كوكتيل مثبط البروتياز الكامل (PIC) سيجما ألدريتش ألكس-522-020-C005 محضرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة DPBS (10x) بدون Ca ، Mg PAN Biotech P04-53500 التخفيف 1:10 مع H2O ، التخزين في الثلاجة عازلة الرحلان الكهربائي عصامي 10x المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي: 60.6 جم تريس 288 جم جلايسين 20 جم SDS AD 2 لتر H2O 1:10 التخفيف قبل الاستخدام جلايسين كارل روث 3908.3 الماعز المضاد للفأر IgG1 HRP الجنوب الحيوي 1070-05 التخفيف 1: 10.000 في PBST + 5٪ حليب الماعز المضادة للفأر IgG2b HRP الجنوب الحيوي 1090-05 التخفيف 1: 10.000 في PBST + 5٪ حليب الماعز المضادة للأرانب IgG-HRP الجنوب الحيوي 4030-05 التخفيف 1: 10.000 في PBST + 5٪ حليب إنترلوكين -2 بشري (hIL-2) ميرك جروب / روش 11011456001 لتنشيط الخلايا التائية كيه سي إل كارل روث 6781.2 كيه 2 ب 4 كارل روث 3904.1 [م] عازل التحميل 4x Laemmli عينة عازلة ، 10 مل بيو راد 161-0747 محضرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لوميناتا فورتي الغربية HRP الركيزة ميليبور WBLUFO500 عازلة التحلل عصامي 13.3 مل Tris-HCl ؛ درجة الحموضة 7.4 ؛ 1.5 م 27.5 مل كلوريد الصوديوم ؛ 5 م 10 مل EDTA ؛ 2 ملم 100 مل Triton X-100 إضافة 960 مل H2O متوسط للخلايا الملتصقة DMEM F12 (1: 1) مع الجلوتامين المستقر ، 2،438 جم / لتر PAN Biotech P04-41154 إضافة 10٪ FCS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 0.0001٪ بوروميسين إلى الوسط وسيط للخلايا التائية الأولية جيبكو من لايف تكنولوجيوجي 21875034 إضافة 10٪ FCS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين إلى الوسط حليب مجفف كارل روث تي 145.4 Na2HPO4 كارل روث P030.3 كلوريد الصوديوم كارل روث 3957.2 PBST عصامي 20x PBST: 230 جم كلوريد الصوديوم 8 جم KCl 56.8 جم Na2HPO4 8 جم KH2PO4 حقوق الطبع والنشر © 2021 مجلة JoVE للتجارب المرئية jove.com الصفحة 3 من 3 20 مل Tween-20 ad 2 L تخفيف H2O 1:20 قبل الاستخدام PBST + 5٪ حليب عصامي 50 جرام حليب مجفف + 1 لتر PBST فا ثيرمو فيشر العلمي R30852801 لتنشيط الخلايا التائية باور باك اتش سي بيو راد برسيشن بلس بروتين ستاندرد أزرق بالكامل بيو راد 161-0373 استخدم ما بين 3-5 ميكرولتر حبات البروتين أ السيفاروز CL-4B نوفو دايركت/ ثي جيير جنرال الإنتقال 17-0780-01 حبات راتنج التقارب المحضرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مكشطه VWR 734-2602 الحزب الديمقراطي الصربي كارل روث 4360.2 شاكر هايدولف أزيد الصوديوم كارل روث ك 305.1 تيميد كارل روث 2367.3 مداخن نقل Trans Blot Turbo صغيرة الحجم بيو راد 170-4270 تستخدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة عازلة نقل TransBlot Turbo 5x بيو راد 10026938 محضرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة غشاء النيتروسلولوز TransBlot Turbo صغير الحجم بيو راد 170-4270 تستخدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ترانس بلوت توربو بيو راد تريس كيمياء مذاب 8,08,51,000 تريتون X-100 كارل روث 3051.4 توين 20 بان ريك Appli Chem 4974,1000