$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: تم الحصول على البروتينات المؤتلفة المستخدمة في هذه الدراسة ، Hsp90 ، و Cdc37 ، تجاريا
(انظر جدول المواد).
1. تنشيط الرقاقة
ملاحظة: يتم سرد جميع المواد التي سيتم استخدامها في التجربة في جدول المواد. قم بتصفية جميع المحاليل المحضرة من خلال مرشح معقم 0.2 ميكرومتر.
- قم بإعداد محلول 1-إيثيل -3- (3-ثنائي ميثيل أمينو بروبيل) كاربوديميد (EDC) عن طريق إضافة 2 مجم من EDC إلى 2.5 مل من 1 M 2- (N-morpholino) حمض السلفونيك الإيثان (MES) (الرقم الهيدروجيني = 6.0) في أنبوب سعة 15 مل. قم بإعداد محاليل N-Hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) عن طريق إضافة 6 مجم من sulfo-NHS إلى 2.5 مل من 1 M MES (الرقم الهيدروجيني = 6.0) في أنبوب منفصل سعة 15 مل. Aliquot 50 ميكرولتر من كل محلول في أنابيب مستقلة وتخزينها عند -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
- امزج كميات متساوية من محلول EDC و sulfo-NHS (50 ميكرولتر من EDC + 50 ميكرولتر من sulfo-NHS) عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل (لا تقم بالدوامة).
ملاحظة: يجب استخدام المحلول المختلط ل EDC / sulfo-NHS في غضون 30 دقيقة للحفاظ على الربط المتقاطع الفعال لوظائف الرقاقة بشكل مناسب.
- ضع شريحة المستشعر الحيوي (5.7 سم × 2.4 سم ؛ انظر جدول المواد) التي توفرها الشركة في طبق بتري زجاجي بغطاء مناسب. يقترح إجراء جميع خطوات الوظيفية المتضمنة في تنشيط الرقاقة داخل طبق بتري. ضع 50 ميكرولتر من 1 M MES (الرقم الهيدروجيني = 6.0) على شريحة المستشعر الحيوي ، واحتضنه لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ثم استنشق المخزن المؤقت.
- ضع 50 ميكرولتر من محلول EDC / sulfo-NHS على الفور على شريحة المستشعر. غطي طبق بتري واحتضانه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنشط محلول EDC / sulfo-NHS من الشريحة.
- اشطف الرقاقة مرة واحدة باستخدام 50 ميكرولتر من 1 M MES (الرقم الهيدروجيني = 6.0) ؛ استنشق المخزن المؤقت MES.
< p class = "jove_title" >2. شلل البروتين
المستهدف
- اشطف الرقاقة 2x ب 50 ميكرولتر من 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4). استنشق PBS من الرقاقة وأضف الجزيء المستهدف ، Hsp90 (50 ميكرولتر ؛ 500 نانومتر).
ملاحظة: قد يؤدي عدم تطابق المخزن المؤقت إلى تدمير التجربة بأكملها. ومن ثم ، قبل التجربة ، من المهم التأكد من أن الجزيء المستهدف في نفس المخزن المؤقت المستخدم للمعايرة (على سبيل المثال ، 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4)). إذا لزم الأمر ، قم بإجراء تبادل عازل عن طريق غسيل الكلى طوال الليل قبل التجربة. في هذه التجربة ، تم إجراء غسيل الكلى بين عشية وضحاها لكل من البروتينات المؤتلفة ، Hsp90 و Cdc37 ، مقابل 1x PBS (درجة الحموضة = 7.4 ؛ انظر جدول المواد) مع تبادل عازل مناسب عند 4 درجات مئوية. قد يختلف تركيز المادة المستهدفة (Hsp90 في هذه الحالة) وفقا للبروتوكولات التجريبية المختلفة وطبيعة المواد المستهدفة (البروتين / الببتيد / الروابط).
- غطي طبق بتري الزجاجي واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنشق المحلول الذي يحتوي على الجزيء المستهدف واشطفه 3x ب 50 ميكرولتر من 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4). استنشق محلول 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4) من الشريحة.
- أضف 50 ميكرولتر من محلول التبريد 1 (3.9 ملي مولار كحول أمينو-PEG5 في 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4)) إلى الشريحة. غطي طبق بتري الزجاجي واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنشق محلول التبريد 1 من الشريحة.
- أضف 50 ميكرولتر من محلول Quench 2 (1 M ethanolamine (الرقم الهيدروجيني = 8.5)) إلى الشريحة. غطي طبق بتري الزجاجي واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بشفط محلول التبريد 2 من الشريحة واشطف الرقاقة 5x باستخدام 50 ميكرولتر من 1x PBS ، مع ترك آخر قطرة PBS على المستشعر.
3. تحضير عينات التحليل
- تحضير سلسلة التخفيف التحليلي ل Cdc37 في نطاق التركيز المطلوب. في التجربة الأولى ، تم استخدام التركيزات التالية: 25 نانومتر ، 50 نانومتر ، 100 نانومتر ، 200 نانومتر ، 400 نانومتر ، 800 نانومتر ، 1000 نانومتر ، 2000 نانومتر ، 3000 نانومتر ، 5000 نانومتر. في التجربة الثانية ، تم استخدام مجموعة مختلفة من التركيزات تتراوح من 0.4 نانومتر إلى 200 نانومتر.
- صمم التجربة لتشمل ما لا يقل عن ثمانية تركيزات مختلفة من المواد التحليلية للحصول على قيمة موثوقة من الديكورات الكويتية. تحضير التخفيفات المختلفة للبروتين التحليلي في نفس المخزن المؤقت المستخدم للمعايرة والبروتين المستهدف ؛ هنا هو 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4).
4. تحميل شريحة المستشعر الحيوي المنشط في جهاز FEB
ملاحظة: يتكون جهاز FEB من قارئ مزود بمؤشرات إضاءة LED وخرطوشة لإدخال شريحة المستشعر الحيوي.
- بعد تثبيت البروتين المستهدف ، أدخل الشريحة المنشطة في خرطوشة الجهاز ، والتي يتم توصيلها عبر USB بجهاز كمبيوتر. بعد إدخال الشريحة ، سيتم عرض ضوء LED أخضر على القارئ يشير إلى أن جهاز FEB جاهز للتجربة. قم بتثبيت البرنامج الآلي (انظر جدول المواد) الذي توفره الشركة على الكمبيوتر ، الذي يتصل به جهاز FEB ، لمراقبة التجربة خطوة بخطوة كما هو موضح أدناه.
5. قم بتشغيل التجربة
- اضغط على وحدة تشغيل التجربة على البرنامج الآلي واختر 10 نقاط مع التجديد أو أي بروتوكول آخر مطلوب. املأ التفاصيل التالية: اسم المشغل ، اسم التجربة ، التاريخ (على سبيل المثال ، Yana ، Hsp90 + Cdc37 ، 14.03.2021) ؛ المخزن المؤقت للتجديد (على سبيل المثال ، المخزن المؤقت PBS) ؛ الهدف الثابت (على سبيل المثال ، Hsp90) ؛ التحليل في المحلول (على سبيل المثال ، Cdc37).
- اضغط على زر بدء التجربة المعروض على البرنامج واتبع الإرشادات التي يعرضها البرنامج الآلي كما هو موضح أدناه.
ملاحظه: البرنامج مؤتمت بالكامل وسهل الاستخدام ويوجه المستخدم طوال التجربة خطوة بخطوة. ستظهر نافذة منبثقة على الشاشة تحتوي على تعليمات للمضي قدما في كل خطوة من خطوات التجربة. سيوفر البرنامج إرشادات لكل خطوة متكررة على التوالي من المعايرة ، وارتباط التحليل ، والتفكك ، والتجديد ، والغسيل (5x) لكل تركيز تحليلي طوال التجربة.
- إجراء معايرة الجهاز. للقيام بذلك ، قم بشفط محلول PBS المتبقي من الرقاقة وقم بتطبيق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمعايرة (1x PBS ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.4). اضغط على زر المتابعة وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تنتهي خطوة المعايرة. يعرض البرنامج نقطة النهاية المحددة لخطوة المعايرة (5 دقائق) مع إنذار تحذير للمتابعة.
- بعد ذلك ، قم بإجراء اقتران تحليلي. للقيام بذلك ، قم بشفط المخزن المؤقت للمعايرة من الرقاقة وقم بتطبيق 50 ميكرولتر من أدنى تركيز للتحليل (25 نانومتر من Cdc37). اضغط على الزر "متابعة" وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تنتهي خطوة الاقتران. يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة الاقتران (5 دقائق) مع إنذار تحذير للمتابعة.
- إجراء تفكك التحليل. للقيام بذلك ، قم بشفط محلول التحليل من الرقاقة وقم بتطبيق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفكك (1x PBS ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.4). اضغط على زر المتابعة وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تنتهي مدة خطوة التفكك (5 دقائق). يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة التفكك (5 دقائق) مع إنذار تحذير للمتابعة.
- بعد ذلك ، قم بإجراء تجديد الرقاقة. استنشق محلول التفكك من الرقاقة وقم بتطبيق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتجديد (1x PBS ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.4). اضغط على زر المتابعة وانتظر لمدة 30 ثانية حتى تنتهي مدة خطوة التجديد (30 ثانية). يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة التجديد (30 ثانية) مع إنذار تحذير للمتابعة.
- أخيرا ، اغسل الشريحة. قم بشفط محلول التجديد من الرقاقة وقم بتطبيق 50 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت (1x PBS ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.4) على الشريحة. استنشق المحلول من الشريحة وكرر هذا 5x. اترك آخر قطرة من مخزن الغسيل المؤقت على الشريحة واضغط على زر المتابعة وانتظر لمدة 30 ثانية حتى تنتهي مدة خطوة الغسيل في شاشة البرنامج.
ملاحظة: يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة الغسيل (30 ثانية) مع إنذار تحذير لمتابعة الدورة التالية من التجربة.
- كرر الخطوات لكل تركيز محلي مستخدم ؛ تشكل الخطوات الخمس للمعايرة ، وارتباط التحليل ، والتفكك ، والتجديد ، والغسيل (5x) دورة واحدة. بالنسبة للتجربة الموضحة هنا ، أجرينا 10 دورات ل 10 تركيزات تحليلية (تتراوح من 25 نانومتر إلى 5,000 نانومتر أو 0.4 نانومتر إلى 200 نانومتر. الشكل 1).
