القياس الضوئي الكتلي لدراسة تفاعلات المستضد والأجسام المضادة على مستوى جزيء واحد

الملخص

المصدر: Wu ، D. et al. ، التحديد السريع لتقارب الأجسام المضادة والمستضد عن طريق القياس الضوئي الكتلي. J. Vis. Exp.(2021)

في هذا الفيديو ، نوضح استخدام القياس الضوئي الكتلي لدراسة تفاعلات المستضد والأجسام المضادة في غرفة التدفق. يتشتت الضوء المركز بشكل مختلف بناء على كتلة الجزيئات. يجمع الكاشف الضوء المتناثر ويولد نمط التداخل كبقع ذات شدة متنوعة ، والتي ترتبط بالكتل الجزيئية.

البروتوكول

p class = "jove_title" >1. تحضير غرف التدفق

1. تنظيف أغطية الزجاج
   1. باستخدام زجاجات الغسيل بالماء المقطر والإيثانول والأيزوبروبانول ، اشطف الغطاء مقاس 24 مم × 50 مم بالترتيب التالي: الماء ، الإيثانول ، الماء ، الأيزوبروبانول ، الماء. جفف الأغطية بتيار من النيتروجين النظيف. من المهم شطف الأغطية من أعلى إلى أسفل ، مع الاحتفاظ بالزاوية السفلية بملقط ناعم. جفف الغطاء في نفس الاتجاه لتجنب نقل التلوث من الملقط (الشكل 1 أ).
   2. وبالمثل ، اشطف الغطاء مقاس 24 مم × 24 مم بالماء المقطر والإيثانول والماء المقطر. جفف الأغطية بتيار من النيتروجين النظيف.
   3. حدد جانب العمل من الغطاء ، ضع قطرة من الماء المقطر على سطح الغطاء النظيف ، واتبع الخطوات 3.1-3.2 من البروتوكول. عادة ما يكون هناك جانب واحد فقط من غطاء الغطاء مقاس 24 مم × 50 مم بالجودة البصرية المناسبة لقياسات MP. < / > ملاحظه: بعد التركيز ، يجب عدم اكتشاف أي عيوب سطحية كبيرة ، ويجب أن تكون قيمة "الإشارة" الموضحة في برنامج جمع البيانات أقل من 0.05٪ (الشكل 2A-C). يتم توجيه جوانب العمل لجميع أغطية الصندوق في نفس الاتجاه. يجب استخدام نفس الإجراء لاختبار كفاءة تنظيف الغطاء.
2. قم بتجميع غرفة التدفق
   1. ضع شريحة الغطاء مقاس 24 مم × 24 مم على قطعة من ورق الألمنيوم. ضع شرائط من الشريط على الوجهين أعلى شريحة الغطاء مقاس 24 مم × 24 مم كما هو موضح في الشكل 1 ب وقم بقص الشريط على طول حافة الزجاج. افصل الغطاء عن رقائق الألومنيوم وقم بتثبيته على جانب العمل من غطاء الغطاء مقاس 24 مم × 50 مم (الشكل 1 ج). < / > ملاحظه: يمكن أن يختلف حجم القناة، ولكن يوصى بعرض 3 مم إلى 5 مم. تتطلب القنوات الأوسع أحجام عينات أكبر وقد يصعب تحميل القنوات الضيقة جدا. عادة ، يمكن بسهولة إنشاء قناتين متوازيتين على زلة الغطاء مقاس 24 مم × 24 مم. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

< p class = "jove_title" >2. قم بإعداد عينات مستضد الجسم المضاد لقياسات التقارب

1. قم بتصفية ما لا يقل عن 2 مل من المخزن المؤقت PBS باستخدام مرشحات حقنة 0.22 ميكرومتر لإزالة جزيئات الغبار أو الركام. الطرد المركزي مخزون البروتين لمدة 10 دقائق بأقصى سرعة لجهاز الطرد المركزي المنضدي (حوالي 16,000 × جم).
   ملاحظه: PBS هو المخزن المؤقت الموصى به لهذا البروتوكول ، لكن MP ليس له متطلبات مخزن مؤقت معينة ، كما أن المخازن المؤقتة البيولوجية الأخرى مقبولة أيضا. ومع ذلك ، قد تؤثر تركيزات الجلسرين العالية (>10٪) والقوة الأيونية المنخفضة جدا (تركيز الملح <10 مليمتر) على جودة الصورة والبيانات ولا ينصح بها.
2. تحديد التركيزات الفعلية لمخزون الأجسام المضادة والمستضد عن طريق قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية 280 نانومتر.
3. احسب التركيزات المقاسة لخليط المستضد والأجسام المضادة. إذا كانت القيمة المقدرة لتقارب ارتباط الجسم المضاد غير معروفة ، فخطط لإعداد عينة بتركيز مستضد 30 نانومتر وتركيز 20 نانومتر من الجسم المضاد. عندما يكون التقارب التقريبي معروفا ، يجب تحسين نسبة الجسم المضاد إلى المستضد وتركيزاتها وفقا لقيم K_d المتوقعة. استخدم تركيز المستضد الكلي في الخليط يساوي مجموع KD المتوقع وتركيز الجسم المضاد الكلي في المعادلة أدناه. بافتراض K_d1 = K_d2 لنظيرتي الجسم المضاد ، سيؤدي ذلك إلى تركيزات مماثلة للجسم المضاد الحر ومجمعات مستضد الجسم المضاد في العينة.
   
   اضبط تركيز الجسم المضاد للحفاظ على تركيز البروتين الكلي في العينة ضمن نطاق 10 نانومتر و 50 نانومتر. يتم الحصول على أفضل النتائج باستخدام مخاليط بتركيزات أجسام مضادة تتراوح بين 5 نانومتر و 25 نانومتر><. ملاحظه: يكتشف MP البروتينات ذات الكتلة الجزيئية التي تزيد عن 40 كيلو دالتون. وبالتالي ، يمكن أن تتجاوز تركيزات عينة المستضدات ذات الكتلة الجزيئية الأصغر من 40 كيلو دالتون الحد النموذجي البالغ 50 نانو أمبير. ومع ذلك ، عند تركيزات أعلى من حوالي 100 نانومتر ، حتى المستضدات ذات الكتلة الجزيئية المنخفضة قد تؤثر على جودة الصورة ودقة تحديد KD.
4. تحضير 50 ميكرولتر من خليط الجسم المضاد والمستضد بتركيز القياس النهائي المحسوب في الخطوة 2.3.
   ملاحظه: مطلوب عينة واحدة فقط من خليط المستضد والأجسام المضادة لتحديد KD. ومع ذلك ، فإن تحضير عدة عينات بنسب مختلفة من المستضد إلى الجسم المضاد يمكن أن يساعد في تحسين تركيز العينة. إذا تم جمع البيانات من عدة عينات ، فيمكن تحليلها عبر ملاءمة عالمية.
5. احتضان خليط (خليط) المستضد والأجسام المضادة لمدة 10 دقائق تقريبا في درجة حرارة الغرفة للسماح لتفاعل الربط بالوصول إلى التوازن الكيميائي. تجنب أوقات الحضانة الطويلة دون داع.
   ملاحظه: قد يختلف وقت الحضانة اعتمادا على حركية الربط. للتأكد من الوصول إلى التوازن الكيميائي ، يمكن تكرار قياسات العينة في أوقات حضانة مختلفة. تشير قيم K_d الثابتة زمنيا إلى حضانة طويلة بما فيه الكفاية. قد تؤدي الحضانة المطولة إلى امتصاص البروتين بشكل كبير على سطح أدوات المختبر البلاستيكية ، وبالتالي إلى أخطاء كبيرة في تحديد تركيز البروتين. لهذا السبب ، يوصى بشدة باستخدام أدوات المختبر منخفضة الالتصاق لإعداد عينة MP.

3. جمع بيانات القياس الضوئي الكتلي

1. ضع قطرة من زيت الغمر بالمجهر على هدف أداة MP وضع غرفة التدفق المجمعة على مرحلة المجهر. تأكد من أن الزيت يمتد على الفجوة بين الغطاء والهدف.
2. قم بتحميل غرفة التدفق وتركيز مقياس الضوء الكتلي.
   1. قم بإيداع 10 ميكرولتر من محلول عازل نظيف ومفلتر في أحد طرفي قناة غرفة التدفق المعدة في الخطوة 1. سوف يدخل السائل القناة عن طريق العمل الشعري.
   2. اضبط موضع Z للمرحلة لتركيز المجهر على سطح عمل زلة الغطاء مقاس 24 × 50 مم.
      1. في علامة التبويب التحكم في التركيز البؤري في برنامج جمع البيانات ، استخدم زري حركة المرحلة الخشنة لأعلى ولأسفل لإجراء التعديلات الأولية.
      2. انقر فوق الزر "حدة" لإظهار قراءة إشارة الحدة واستخدم أزرار الضبط لأعلى ولأسفل الدقيقة لزيادة قيمة الحدة.
      3. انقر على ضبط التركيز وقفل التركيز البؤري زرين لتنشيط وظيفة تتبع التركيز البؤري. يجب أن يكون للصورة المركزة بشكل صحيح (الشكل 2 أ ، ج) قيمة "إشارة" أقل من 0.05٪.
         ملاحظه: إذا كانت قيمة "الإشارة" عند موضع الحدة الأقصى أعلى من 0.05٪ ، فقد يشير ذلك إلى وجود شوائب على سطح الزجاج أو في المخزن المؤقت.
3. باستخدام نفس القناة ، قم بتحميل 20 ميكرولتر من عينة مستضد الجسم المضاد عن طريق ترسيبها على جانب واحد من القناة ونشاف السائل من الطرف الآخر بقطعة صغيرة من ورق النشاف (الشكل 1D).
   ملاحظه: يبلغ حجم القناة التي يتراوح عرضها بين 3 و 5 مم حوالي 10 ميكرولتر. يوصى بحجم العينة الإضافي لاستبدال المخزن المؤقت الموجود في القناة بالكامل ولتجنب تخفيف العينة.
4. بعد تحميل العينة ، انقر على الفور فوق سجل زر لبدء جمع البيانات ، والحصول على فيديو مدته 100 ثانية (الشكل 2D).
5. في نهاية جمع البيانات، أدخل اسم الملف وانقر فوق موافق لحفظ ملف البيانات.
6. تخلص من أغطية الغطاء وامسح الزيت من العدسة الموضوعية بمسحات قطنية بصرية مبللة بالأيزوبروبانول.
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

4. تحليل بيانات MP

1. قم بمعالجة ملف الفيديو الذي تم جمعه باستخدام برنامج معالجة بيانات MP لتحديد أحداث الهبوط.
   1. استخدم خيار القائمة ملف/فتح لتحميل الملف للتحليل وانقر فوق تحليل.
   2. انقر على تحميل زر لتحميل وظيفة المعايرة وحفظ البيانات التي تم تحليلها باستخدام ملف / حفظ النتائج باسم خيار القائمة.
2. تناسب توزيع الكتلة الجزيئية مع وظائف Gaussian للحصول على تركيزات نسبية لكل نوع في العينة. يمكن إجراء هذا التحليل باستخدام برنامج رسوم بيانية علمي شائع (انظر جدول المواد).
   1. قم باستيراد الملف "eventsFitted.csv" إلى البرنامج ورسم توزيع الكتلة الجزيئية (العمود M في ملف .csv) باستخدام وظيفة Plot / Statistics / Histogram.
   2. انقر نقرا مزدوجا فوق الرسم البياني لفتح نافذة خصائص المؤامرة. قم بتعطيل التجميع التلقائي وحدد حجم حاوية 2.5 كيلو دالتون. انقر فوق الزرين تطبيق والانتقال لإنشاء بيانات مراكز المهملات والعد.
   3. حدد عمودي مراكز الحاوية والأعداد واستخدم وظيفة القائمة تحليل/القمم وخط الأساس/ملاءمة الذروة المتعددة لملاءمة الرسم البياني مع الدالات الغوسية. انقر نقرا مزدوجا للإشارة إلى مواضع الذروة التقريبية على مخطط التوزيع ثم انقر فوق الزر افتح NLFit.
   4. حدد مربعات الاختيار الثابتة لمراكز الذروة "xc" وقم بتعيين قيمها على الكتل الجزيئية المتوقعة للجسم المضاد الحر ومجمعات الأجسام المضادة المستضد المفردة والمزدوجة. تحقق من خيار المشاركة لمعلمات العرض. انقر فوق الزر Fit. تمثل قيم ارتفاع الذروة الملائمة للمكونات الغوسية التركيز النسبي لكل نوع في العينة.
      ملاحظه: يمكن تعديل حجم الحاوية لتحسين دقة مخطط التوزيع الشامل. يبلغ حد دقة MP حوالي 1 كيلو دالتون ، وقد تؤدي أحجام الصناديق الأصغر إلى تضخيم ضوضاء التوزيع ، مع عدم الكشف عن أي معلومات إضافية. ستحجب أحجام الصناديق الكبيرة جدا التفاصيل الدقيقة للتوزيعات الجماعية.
3. احسب كسر تركيز كل نوع باستخدام المعادلة التالية:
   
   حيث تمثل قيم H_I و F_I ارتفاعات الذروة وكسور التركيز للجسم المضاد الحر والجسم المضاد أحادي ومزدوج الصلة في العينة ، على التوالي.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: إعداد وتحميل غرفة تدفق MP. (أ) وضع تثبيت الغطاء لإجراء التنظيف. (ب) محاذاة الغطاء مقاس 24 × 24 مم (الطبقة الوسطى) والشريط على الوجهين (الطبقة العلوية) على سطح رقائق الألومنيوم (الطبقة السفلية ، غير معروضة). تظهر الخطوط الزرقاء المتقطعة موقع خطوط القطع. (ج) منظر علوي وجانبي لغرفة التدفق المجمعة مع قناتين عينتين ، وصورة لغرفة التدفق...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات اكتساب إم بي ريفين برنامج MP لجمع البيانات الثرومبين المضاد للإنسان تقنيات أمراض الدم AHT-5020 RRID: AB_2864302 أدوات تطبيق ذات رؤوس قطنية ثورلاب CTA10 مسحات بصرية قطنية لتنظيف العدسات أغطية 24x24 مم الكرة الأرضية العلمية 1405-10 أغطية 24x50 مم فيشر ساينتيك 12-544-ب برنامج DiscoverMP ريفين برنامج معالجة البيانات MP ملقط علوم المجهر الإلكتروني 78080-سي إف ملقط ناعم الرأس لمناولة الغطاء α الثرومبين البشري تقنيات أمراض الدم HCT-0020 زيت الغمر ثورلاب مويل -30 إيزوبوبانول ألفا إيسار 36644 مايكروسوفت إكسل مايكروسوفت جدول ون ميجابكسل ريفين أداة القياس الضوئي الكتلي أصل مختبر أوريجين برنامج الرسوم البيانية العلمية برنامج تلفزيوني كورنينج 46-013 سم مخزون 10x مرشح الحقنة ميليبور SLGSR33SS المخزن المؤقت وتصفية العينات