< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير وسادة الاغاروز (الشكل 1)
- ضع شريحة زجاجية مجهرية على سطح أفقي مستو. رتب شريحتين زجاجيتين تعلوهما طبقتان من الشريط اللاصق على كل جانب من جوانب الشريحة الأولية.
ملاحظه: احتفظ بمسافة 1-2 مم بين الشرائح الثلاثة المحاذاة لمنع انتشار الاغاروز المذاب في النهاية على الشرائح بشريط لاصق.
- ماصة وصب قطرة من 70 ميكرولتر من 1٪ من الاغاروز المذاب على الشريحة الزجاجية. أضف شريحة رابعة في الأعلى لتسطيح قطرة الاغاروز واضغط لأسفل برفق. انتظر حوالي دقيقة.
- انزع الشريحة العلوية وأسقط بماصة حوالي 3 ميكرولتر من البكتيريا إلى 3 إلى 4 بقع في مواقع مختلفة على وسادة الاغاروز.
- قم بتغطيتها بغطاء زجاجي مجهري (على سبيل المثال سمك 22 × 22 مم # 1.5).
ملاحظه: تسطيح وسمك الغطاء مهمان للعمل مع الإثارة ثنائية الفوتون. عادة ما تكون الأغطية الدقيقة ذات التسطيح الموحد المتحكم فيه والتألق الذاتي المنخفض خيارا جيدا.
- قم بتثبيت الغطاء بالبارافين المذاب لإغلاق الغطاء على الشريحة الزجاجية. ابدأ بتثبيت الزوايا الأربع للغطاء.
2. التصوير باستخدام إعداد الفحص المجهري ثنائي الفوتون
ملاحظة: نحن نستخدم مجهر مقلوب محلي الصنع لمسح الإثارة ثنائية الفوتون مع هدف غمر الماء 60x 1.2NA يعمل في وضع تجميع التألق غير الممسوح ضوئيا. تم ضبط الطول الموجي للإثارة ثنائية الفوتون على 930 نانومتر. يتم توفيره بواسطة ليزر Ti: Sapphire (معدل تكرار 80 ميجاهرتز ، ≈ عرض نبضة 70 fs) يعمل عند 10-20 ميجاوات. تم جمع الفوتونات الفلورية من خلال مرشح تمرير قصير 680 نانومتر ومرشح تمرير نطاق 525/50 نانومتر قبل توجيهها إلى الصمام الثنائي الضوئي للانهيار الجليدي المقترن بالألياف المتصل بوحدة عد الفوتون الفردي المرتبطة بالوقت (TCSPC). تم تجهيز المجهر أيضا بمصباح مضان ناقل الحركة. تتوفر الآن العديد من مجاهر FLIM-FRET تجاريا والعديد من مرافق التصوير مجهزة بإعدادات قادرة على إجراء قياسات FLIM-FRET.
- استخدم المصباح الفلوري لتركيز الهدف على الطبقة الأحادية للبكتيريا في العينة وتحديد مناطق الاهتمام.
- تأكد من إغلاق مصراع ليزر الإثارة وأن ضوء الأشعة تحت الحمراء القادم من الليزر محظور ولا يدخل المجهر.
أنذر: يجب إيلاء اهتمام دقيق ويقظة مستمرة عند العمل مع الليزر النبضي بالأشعة تحت الحمراء حيث لا يمكن رؤية ضوء الليزر بالعينين ولكن أي عرض مباشر عابر أو انعكاس ليزر يمكن أن يكون ضارا للغاية ويسبب ضررا لا رجعة فيه للعين. يرجى الرجوع إلى إجراءات السلامة والتدريب المحلي بالليزر قبل استخدام إعدادات الفحص المجهري.
- ضع شريحة الفحص المجهري على المسرح بحيث تواجه أغطية الهدف.
- تأكد من أن المصباح الفلوري قيد التشغيل.
- أدر برج مكعب المرشح لتحديد مكعب eGFP وافتح غالق المصباح الفلوري.
- أرسل ضوء التألق باتجاه عدسة المجهر.
تنبيه: تأكد من التخلص من المرشحات المناسبة في مسار الضوء للتخلص من ضوء الإثارة المباشر القادم من المصباح الفلوري الذي يمكن أن يتلف العينين.
- ركز الهدف على البكتيريا باستخدام مقبض المجهر.
- حدد منطقة الاهتمام في العينة عن طريق ترجمتها باستخدام عصا التحكم التي تتحكم في المرحلة الآلية
ملاحظه: يكون التركيز أسهل مع العينات عالية الفلورسنت مما يسمح برؤية التألق مباشرة بالعينين.
- قم بتبديل الإثارة لليزر 2PE لقياسات FLIM-FRET.
- أرسل مسار انبعاث التألق مرة أخرى نحو الكاشف.
- أعد برج مكعب المرشح لتحديد المكعب ثنائي اللون لليزر 930 نانومتر.
- اضبط طاقة الليزر على 20 ميجاوات.
- اضبط حجم المنطقة محل الاهتمام على 30 ميكرومتر. تقوم هذه العملية بضبط الجهد الذي يقوم بتشغيل مرايا galvo وتحديد نطاق تحركاتها (الشكل 2).
- قم بتشغيل الكاشف وابدأ في مسح العينة - يتحكم أزرار البدء والإيقاف التي تتحكم في المسح الضوئي أيضا في فتح وإغلاق مصراع الليزر لأسباب تتعلق بالسلامة وللحد من التبييض الضوئي للعينة (الشكل 2).
- إذا لزم الأمر ، اضبط التركيز عن طريق تحريك مقبض التركيز الدقيق بالمجهر قليلا.
- اختر مجال الرؤية للتصوير عن طريق تحريك المسرح بدقة من واجهة الكمبيوتر. يمكن القيام بذلك في الإعداد عن طريق تحريك الصليب على الصورة في برنامج التحكم في المجهر (الشكل 2) الذي سيحدد المركز الجديد للصورة والضغط على "تحريك المرحلة". يتوافق مجال الرؤية الجيد للاكتساب مع صورة بها 10-30 بكتيريا غير متحركة ، وكلها مركزة بشكل صحيح (جميع البكتيريا على نفس المستوى). إذا كنت مهتما باستخراج بيانات FLIM-FRET المفردة ، فتأكد من أن البكتيريا فردية جيدا (سيكون تجزئة الصورة أسهل بكثير).
