مقايسة تجميع الخلايا للكشف عن التفاعلات العابرة بين جزيئات التصاق الخلايا

Abstract

المصدر: Restrepo ، S. ، et al. ، قياس التفاعلات عبر الخلايا من خلال تجميع البروتين في نظام خلوي غير متجانس. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية قياس التفاعلات عبر الخلايا بين جزيئات التصاق الخلايا المشبكية من خلال مقايسة تجميع خلايا HEK. في هذا الفحص ، يتم خلط عدد متساو من خلايا HEK التي تعبر عن جزيء التصاق الخلية قبل المشبكي المطلوب وبروتين الفلورسنت مع خلايا HEK التي تعبر عن جزيء التصاق الخلية بعد التشابك وبروتين فلوري آخر. يجبر التفاعل بين جزيئات التصاق الخلية الخلايا على التجمع ، والتي يمكن قياسها عن طريق المجهر الفلوري.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. زراعة الخلايا والتعداء

1. اصنع وسائط خلوية HEK باستخدام DMEM ، 1x (تعديل Dulbecco لوسط النسر) مكمل ب 4.5 جم / لتر من الجلوكوز ، و L-glutamine وبيروفات الصوديوم ، و 10٪ FBS. مرشح معقم.
2. التحديد المسبق للروابط والمستقبلات المناسبة لمقايسة التجميع.
   ملاحظه: تم استخدام Neurexin3α SS4 +/- وأحد الروابط المعروفة ، LRRTM2 ، في هذه الدراسة. تم التعبير عن الروابط والمستقبلات ذات الأهمية من الحمض النووي (cDNAs) في pcDNA3.1. تم استخدام مجموعة جيبسون لإدخال Neurexin3α في pcDNA3.1. Neurexin3α F / R:
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. تحضير HEK293T الخلايا.
   1. تنمو الخلايا HEK293T إلى التقاء في قارورة واحدة من طراز T-75.
   2. بمجرد التقاء ، استخدم 2 مل من التربسين وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. أضف 6 مل من وسائط HEK إلى القارورة لإعادة تعليق الخلايا ونقل كل 8 مل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
   3. بيليه في 500 × جم لمدة 5 دقائق وإعادة تعليقه في وسائط خلية HEK ليصبح المجموع 8 مل.
   4. عد الخلايا وأضف 735,000 خلية في كل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار. اضبط الحجم النهائي على 2 مل لكل بئر باستخدام وسائط خلية HEK.
   5. ضعها في حاضنة 37 درجة مئوية واترك الخلايا تنمو طوال الليل أو حتى تصل إلى 50-60٪ من التقاء.
قم
4. بنقل الخلايا HEK293T باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم.
   1. بئر شفاف -1 مع 3 ميكروغرام من البروتين محل الاهتمام ومشترك مع 1 ميكروغرام من البروتين الفلوري (3 ميكروغرام من pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- و 1 ميكروغرام من mCherry).
   2. Transfect well-2 كما في الخطوة 1.4.1. ولكن مع البروتين المتحور محل الاهتمام (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. بئر شفاف -3 مع 3 ميكروغرام من الترابط محل الاهتمام وترانسيفكت مشترك مع 1 ميكروغرام من بروتين فلوري آخر (3 ميكروغرام من pcDNA3.1 LRRTM2 و 1 ميكروغرام من GFP).
   4. Transfect جيدا -4 و well-5 لتكون بمثابة عناصر تحكم سلبية: بئر -4 مع 1 ميكروغرام من GFP وبئر -5 مع 1 ميكروغرام من الكرز.
   5. قم بإعداد لوحة أخرى (كما في الخطوات 1.4.1-1.4.4) إذا كانت تتطلب شروطا أو عناصر تحكم إضافية (Neurexin3α^{WT / A687T} SS4 +).
      ملاحظه: يتم تحليل كفاءة التعدي بعد 24 ساعة من التعدي تحت مجهر التألق وقياسها كميا على أنها عدد الخلايا التي تعبر عن البروتين الفلوري التي تم نقلها بها. سيشمل النهج الأكثر انسيابية تعدي خلايا HEK مع ترميز ناقل ثنائيسترونيك لبروتين الفلورسنت والترابط محل الاهتمام ويوصى به بشدة فوق التعداء المشترك. في حالة هذه الدراسة ، فإن ألفا نيوريكسينات هي ~ 4.3 كيلو بايت ولوحظت كثافة مضان منخفضة باستخدام نظام ثنائيسترونيك يستلزم التعداء المشترك.
5. بعد 48 ساعة من التعداء ، قم بحصاد الخلايا للتجميع.
   1. اغسل كل منهما جيدا مرتين باستخدام PBS.
   2. أضف 1 مل من 10 ملي مولار EDTA في PBS إلى كل بئر لفصل التفاعلات برفق من خلية إلى خلية واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق < br / > ملاحظه: لا ينصح باستخدام التربسين للخطوة 1.5.ب بسبب الانقسام المحلل للبروتين المحتمل لجزيئات الالتصاق في الدراسة. بالإضافة إلى ذلك ، بعد إضافة EDTA ، قد لا يتم إيقاف البروتوكول حتى اكتماله حيث ستتعرض الخلايا الآن للظروف المحيطة.
   3. اضغط برفق على اللوحة لفصل الخلايا ، وحصاد كل بئر في أنابيب مخروطية منفصلة سعة 15 مل.
   4. أنابيب مخروطية للطرد المركزي عند 500 × جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
6. أثناء تكوير الخلايا ، قم بإعداد 6 أنابيب حضانة عن طريق وضع العلامات على الجزء العلوي من كل أنبوب طرد مركزي دقيق مع كل حالة.
   ملاحظه: يجب استخدام كل تبديل لظروف GFP و mCherry لتشمل جميع الظروف التجريبية والضوابط المناسبة. على سبيل المثال: 1. GFP / mCherry ، 2. mCherry / LRRTM2-GFP 3. GFP / Neurexin3α^WT SS4- - mCherry ، 4. GFP / Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry ، 5. Neurexin3α^WT SS4- - mCherry / LRRTM2 - GFP ، 6. Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry / LRRTM2 — GFP. اصنع أنابيب إضافية لاستيعاب المزيد من الظروف والضوابط.
7. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من وسائط HEK مع 10 ملي CaCl₂ و 10 ملي ملي MgCl₂ دافئ إلى 37 درجة مئوية.
   ملاحظه: تسمح إضافة CaCl₂ و MgCl₂ لجزيئات الالتصاق بإعادة الارتباط وهي مطلوبة فقط إذا كان شركاء التفاعل عبر الخلايا المعنيين يحتاجون إلى كاتيونات ثنائية التكافؤ للالتصاق.
8. عد الخلايا في كل أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام مقياس كثافة الدم وتناول 200,000 خلية من كل حالة في أنبوب مناسب من الخطوة 1.6 لمزيج 1: 1 بحجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر.
   ملاحظه: يجب أن يستغرق الأمر 5 دقائق فقط لكل شرط لحساب المبالغ وحصصها.
9. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة في أنبوب دوار بطيء.

2. الحصول على الصور

1. تحسين معلمات الحصول على المجهر لعينات محددة. في هذا المثال ، تم التقاط الصور على مجهر واسع المجال. استخدم هدفا جويا 5x (NA: 0.15; WD: 20000 ميكرومتر) للحصول على مجال كبير بما يكفي للتحليل.
2. تقييم تراكم خط الأساس مباشرة بعد خلط شرطي خلايا HEK في الخطوة 1.8. هذه هي الآن صور "الوقت صفر".
   1. الماصة 40 ميكرولتر من كل خليط عينة على شريحة مجهرية مشحونة وصورة تحت التألق في كل من القناتين 488 و 561.
   2. احصل على ثلاثة مجالات رؤية مختلفة في مستوى تركيز بؤري واحد لكل قطرة عينة.
3. احصل على الصور النهائية في 60 دقيقة كصورة "الوقت 60".
   1. للحصول على صورة "الوقت 60" للخليط بعد حضانة لمدة 60 دقيقة ، خذ عينة أخرى سعة 40 ميكرولتر من كل حالة من الأنابيب الدوارة وقم بوضع كل عينة على شريحة مشحونة. الصورة كما في الخطوة 2.2.
      ملاحظه: يجب فحص تراكم الخلايا كل 15 دقيقة حتى يحدث التشبع. يعتمد توقيت التجميع على البروتينات التي يتم اختبارها.

Materials