مقايسة ربط القرب لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في الموقع

الملخص

المصدر: Wang، X.، et al. ، الكشف في الموقع عن مجموعة مركب البروتين النووي الريبي في C. ايليجانس السلالة الجرثومية باستخدام مقايسة ربط التقارب.J. Vis. Exp.(2020)

يصف هذا الفيديو مقايسة ربط القرب لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في الموقع في خلايا الديدان الخيطية. يؤدي القرب الشديد من البروتينات ذات الأهمية إلى إنشاء قالب الحمض النووي الدائري بمساعدة مسبار PLA المتصل بجسم مضاد ثانوي. يتم تضخيم المسبار بشكل أكبر باستخدام محلول التضخيم ، والذي ينتج حمض نووي طويل أحادي الشريطة متبوعا بتهجين مسبار الكاشف ، مما يتيح توطين تفاعلات البروتين والبروتين في الخلايا.

البروتوكول

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول سلالات C. ايليجانس حيث يتم تمييز الشركاء المتفاعلين المحتملين. يوصى بشدة باستخدام سلالة تحكم سلبية ، حيث لا يتوقع أن يتفاعل بروتين واحد مع شريك تفاعل مرشح آخر تم وضع علامة عليه. هنا ، تم استخدام GFP وحده كعنصر تحكم سلبي لتقييم الخلفية ، حيث لا يتوقع أن يتفاعل DLC-1 مع GFP في الدودة. تم استخدام OMA-1 الموسومة ب GFP كسلالة تجريبية ، حيث تشير البيانات الأولية إلى تفاعل مع DLC-1. يشار إلى سلالات الديدان الخيطية التي تعبر عن بروتينات التحكم والاختبار المشتركة مع DLC-1 الموسومة 3xFLAG في هذا النص باسم 3xFLAG: :D LC-1; GFP و 3xFLAG: :D LC-1 ؛ OMA-1::GFP (السلالات متوفرة عند الطلب ؛ مزيد من المعلومات في جدول المواد) ، على التوالي. هنا ، يتم استخدام علامات 3xFLAG و GFP ؛ ومع ذلك ، يمكن استبدال العلامات الأخرى طالما أن أجسامها المضادة متوافقة مع كواشف مجموعة PLA.

< p class = "jove_title" >1. رعاية

1. احتفظ بالديدان على ألواح وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) التي يتم زرعها بسلالة OP50 من الإشريكية القولونية والحفاظ عليها عند 24 درجة مئوية للتعبير الأمثل عن GFP.
2. قم بتمرير الديدان البالغة كل 2-3 أيام لتكاثر الديدان وإبقائها جيدة التغذية.

2. إعداد الثقافة المتزامنة

1. قم بمزامنة الديدان عن طريق تبييض طبق من الخنثى الجيدة التغذية. تم وصف بروتوكول التبييض في Porta-de-la-Riva et al. دع الأجنة تفقس طوال الليل في أنبوب طرد مركزي عند 24 درجة مئوية أثناء الدوران من طرف إلى طرف في 10 مل من المخزن المؤقت للوسائط الدنيا M9 (M9). سينتج عن ذلك ثقافة يرقات L1 المعتقلة.
2. احتضان أنبوب يرقات المرحلة L1 التي تم القبض عليها على الجليد لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتغطية الأنبوب بالثلج البارد 1x M9.
3. استخدم جهاز طرد مركزي لحبيبات اليرقات عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
4. أعد تعليق حبيبات اليرقات واستخدم ماصة دقيقة لنقل 2 ميكرولتر من مزرعة اليرقات العالقة إلى شريحة زجاجية. احسب عدد اليرقات الموجودة لتحديد كثافة ثقافة اليرقات ، مما سيساعد في توجيه بذر الديدان في الخطوة 2.5.
   ملاحظه: كثافة 10-15 L1 يرقات / 1 ميكرولتر تعمل بشكل جيد للبذر.
5. استخدم ماصة دقيقة لنقل حجم زراعة اليرقات اللازمة لزرع ما يقرب من 100-120 يرقات من المرحلة L1 على صفيحة OP50 مقاس 60 مم. على سبيل المثال ، قم ببذور 10 ميكرولتر من مزرعة اليرقات التي تبلغ كثافتها 10 L1 يرقات / 1 ميكرولتر من الثقافة.
   ملاحظه: لا تتجاوز حجم 40 ميكرولتر لبذر اليرقات ، وإلا فإن السائل الزائد سيعطل عشب OP50. إذا تجاوز حجم المزرعة 40 ميكرولتر ، كرر الخطوات 2.3-2.4 لتقليل الحجم وزيادة كثافة زراعة اليرقات.
6. تنمو الديدان عند 24 درجة مئوية. سجل الوقت الذي يتم فيه زرع الديدان L1s على الطبق وتحقق بشكل دوري من مرحلة التطور لتحديد الوقت المثالي للتشريح.
   ملاحظه: بعد 52 ساعة من بذر L1s ، عادة ما تكون الديدان المستزرعة عند 24 درجة مئوية في مرحلة الشباب البالغين ، وهي المرحلة المثالية لتشريح جيش التحرير الشعبى الصينى المستهدف بالغ التناسلية. ومع ذلك ، فإن الوقت الفعلي الذي تصل فيه الديدان المتزامنة إلى مرحلة الشباب قد يختلف بين السلالات ودرجة حرارة الحضانة.

< p class = "jove_title" >3. تشريح / بثق الغدد التناسلية

ملاحظة: يعد التشريح لبثق الغدد التناسلية ضروريا لعمل PLA الذي يستهدف الغدد التناسلية بنجاح. يمكن لهذا النهج أيضا إطلاق الأجنة ، والتي تعمل أيضا باستخدام هذا البروتوكول لجيش التحرير الشعبى الصينى (انظر المناقشة لمزيد من المعلومات). بعد التشريح ، يتم إصلاح كل من عينات التحكم السلبية والتجريبية ومعالجتها من أجل PLA معا بالتوازي. يقترح أيضا إعداد مجموعة إضافية من العينات لغرض التلوين المناعي المشترك للفلورسنت لإظهار أنماط التعبير عن شركاء البروتين المهتمين.

1. اختر 30-40 دودة شابة في طبق زجاجي للساعة يحتوي على 500 ميكرولتر من 1x M9 + ليفاميزول (تركيز نهائي 2.5 ملليمتر). بعد جمع الديدان ، قم بإزالة معظم الوسائط بعناية والتخلص منها لإزالة البكتيريا المنقولة مع الديدان.
2. أضف 500 ميكرولتر طازجا من 1x M9 + ليفاميزول واستخدم الماصة لسحب الوسائط وتوزيعها برفق لشطف الديدان. قم بإزالة معظم الوسائط والتخلص منها بعناية لإزالة البكتيريا المنقولة مع الديدان.
   1. كرر هذه الخطوة 2x-3x حتى تتم إزالة جميع البكتيريا. بعد اكتمال الغسيل ، اترك الديدان في حوالي 100 ميكرولتر من الوسائط للحفاظ على رطوبتها.
      ملاحظه: لا تدع الديدان تجلس في الوسائط لمدة تزيد عن 7 دقائق ، لأن ذلك سيضعف بثق الغدد التناسلية أثناء التشريح. قم بإجراء عمليات الغسيل بمساعدة مجهر تشريح لمراقبة إزالة الوسائط حتى لا تضيع الديدان.
3. باستخدام ماصة زجاجية أو بولي إيثيلين، انقل الديدان إلى شريحة مجهر مقاس 25 مم × 75 مم مطلية ب 0.001٪ بولي إل-ليسين (تحتوي الشرائح المستخدمة في هذا الإجراء على محيط مطلي بالإيبوكسي، تاركة ثلاث مساحات عمل، 14 مم × 14 مم لكل منها). قم بإزالة الوسائط الزائدة بحيث يتبقى ما يقرب من 10-15 ميكرولتر من الوسائط.
4. بمساعدة مجهر تشريح وباستخدام إبرتين بقياس 26 بوصة ، ضع إبرة واحدة فوق الأخرى بحيث تشكل الأطراف مقصا. باستخدام الإبر الموجهة بهذه الطريقة ، قم بقطع الديدان خلف البلعوم لتحرير السلالات الجرثومة. تشريح جميع الديدان في غضون 5 دقائق.
   ملاحظه: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول كيفية إجراء التشريح في منشور سابق بقلم Gervaise و Arur.
5. بعد تشريح جميع الديدان، ضع برفق غطاء مقاس 22 مم × 40 مم فوق الشريحة بحيث تكون عمودية على الشريحة. يجب أن تتدلى نهايات الغطاء من الشريحة.
6. قم بتجميد الشرائح على كتلة من الألومنيوم المبرد مسبقا محفوظة على الثلج الجاف لمدة 20 دقيقة على الأقل. ضع قلم رصاص مبرد برفق فوق الغطاء لمنع انزلاق الغطاء من أن يصبح فضفاضا بسبب تمدد الجليد.

< p class = "jove_title" >4. التثبيت / الحظر

1. عندما تكون جاهزا للتثبيت ، قم بإزالة أغطية الغطاء بقلم رصاص أو أي أداة أخرى ذات حواف حادة واغمس الشريحة على الفور في وعاء يحتوي على الميثانول الطازج المثلج (المبرد إلى -20 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة.
2. امسح حواف الشريحة التي تحيط بالعينة برفق بحيث يتم تثبيت الكاشف التالي بواسطة التوتر السطحي حول العينة. ضع 150 ميكرولتر من المثبت (2٪ فورمالديهايد في 100 ملي مولار KH₂PO_{4 ،} الرقم الهيدروجيني = 7.2) لمدة 5 دقائق عند RT.
   ملاحظه: لقد اختبرنا أيضا إجراء تثبيت الميثانول / الأسيتون ووجدنا أنه متوافق مع تفاعل PLA.
3. المس الشريحة بمنشفة ورقية بزاوية عمودية 90 درجة للسماح للمثبت بالخروج من الشريحة وامتصاصه في المنشفة الورقية. قم بتجميع الشرائح 2x لمدة 15 دقيقة في RT في وعاء Coplin مع 50 مل من 1x PBS / 1٪ Triton X-100 / 1٪ ألبومين مصل بقري (PBT / BSA).
   ملاحظه: يوصى باستخدام برطمانات Coplin أو أنواع أخرى من برطمانات التلوين لخطوة الحظر هذه وخطوات الغسيل أدناه في الأقسام 6-9. توفر هذه كميات كافية للتبادل الفعال للحجب أو الغسيل مع العينة.
4. قم بحظر الشرائح بمحلول PBT / BSA الذي يحتوي على مصل الماعز العادي بنسبة 10٪. امسح الحواف التي تحيط بالشريحة برفق وقم بتطبيق 100 ميكرولتر من المحلول على الشريحة. احتضان لمدة 1 ساعة في RT في غرفة رطبة.
   ملاحظه: يوصى بشدة بهذه الخطوة للتلوين بالجسم المضاد الأساسي αFLAG. يتم إنشاء الغرفة الرطبة عن طريق تثبيت الماصات الزجاجية بشريط لاصق في الدرج حتى توضع الشرائح عليها أثناء احتضانها. يتم وضع مناديل المهام المبللة (جدول المواد) في الدرج لرفع الرطوبة الداخلية للدرج لمنع التبخر. الغطاء والصينية مغطاة بورق الألمنيوم لحماية العينات من الضوء أثناء الخطوات الحساسة للضوء.
5. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح لمحلول PBT / BSA / 10٪ NGS بالخروج من الشريحة وامسح حواف الشريحة برفق. استخدم كاشف الحجب (جدول المواد) لحجب الشرائح. ضع قطرة واحدة على المسافة 14 مم × 14 مم. احتضان الشرائح لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.

< p class = "jove_title" >5. حضانة الأجسام المضادة الأولية

ملاحظة: للحصول على أفضل نتائج PLA والحد الأدنى من الخلفية ، قد يتطلب عامل التخفيف للأجسام المضادة الأولية التحسين (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل). بالإضافة إلى ذلك ، يجب رفع الأجسام المضادة الأولية في مضيفين مختلفين يتطابقون مع خصوصية الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في جيش التحرير الشعبى الصينى.

1. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح للكاشف المانع بالخروج من الشريحة وامسح الحواف برفق. استخدم مخفف الجسم المضاد (جدول المواد) لتخفيف الأجسام المضادة الأولية. ضع 40 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل مسافة 14 مم × 14 مم.
2. احتضان الشرائح في غرفة رطبة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

فئة

6. حضانة مسبار PLA (الجسم المضاد الثانوي)

ملاحظة: بالنسبة للخطوات 6-9، استخدم مخازن الغسيل A وB في RT. إذا تم تخزين المخازن المؤقتة عند 4 درجات مئوية ، فاتركها دافئة إلى RT قبل الاستخدام.

1. اغسل الشرائح 2x لمدة 5 دقائق باستخدام 50 مل من 1x wash buffer A (جدول المواد) في RT في جرة Coplin. اضبط جرة Coplin على شاكر مداري مضبوطة على 60 دورة في الدقيقة.
2. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح لمخزن الغسيل بالجريان من الشريحة وامسح الحواف برفق. تحضير محلول 40 ميكرولتر يحتوي على مجسات PLUS و MINUS (مخفف بنسبة 1: 5 مع مخفف الجسم المضاد). ضع المحلول على كل مساحة 14 مم × 14 مم.
3. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

< ص الفئة = "jove_title" >7. الربط

1. اغسل الشرائح 2x لمدة 5 دقائق مع 50 مل من 1x wash buffer A في RT في وعاء Coplin. اضبط جرة Coplin على شاكر مداري مضبوطة على 60 دورة في الدقيقة.
2. تمييع المخزن المؤقت للربط (جدول المواد) 1: 5 بالماء عالي النقاء. استخدم هذا المخزن المؤقت لتخفيف الليغاس (جدول المواد) 1:40 لإعداد مخزون عمل من محلول الربط.
   1. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح لمخزن الغسيل بالجريان من الشريحة وامسح الحواف برفق. ضع 40 ميكرولتر من محلول الربط على كل مسافة 14 مم × 14 مم.
3. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >8. تضخيم

ملاحظة: يؤدي استخدام كواشف الكشف مع الفلوروفورات الحمراء (جدول المواد) إلى أقل قدر من الخلفية في C. ايليجانس الأنسجة.

1. اغسل الشرائح 2x لمدة 5 دقائق مع 50 مل من 1x wash buffer A في RT في وعاء Coplin. اضبط جرة Coplin على شاكر مداري مضبوطة على 60 دورة في الدقيقة.
2. تمييع المخزن المؤقت الأحمر للتضخيم (جدول المواد) 1: 5 بالماء فائق النقاء. استخدم هذا المخزن المؤقت لتخفيف البوليميراز (جدول المواد) 1:80 لإعداد مخزون عمل من محلول التضخيم والحماية من الضوء.
   1. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح لمخزن الغسيل بالجريان من الشريحة وامسح الحواف برفق. ضع 40 ميكرولتر من محلول التضخيم على كل مساحة 14 مم × 14 مم.
3. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة و 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تأكد من تغطية الغرفة الرطبة بورق الألمنيوم لحماية العينات من الضوء.

< ص الفئة = "jove_title" >9. الغسيل النهائي

1. اغسل الشرائح 2x لمدة 10 دقائق مع 50 مل من 1x washs buffer B (جدول المواد) في RT في جرة Coplin. اضبط جرة Coplin على شاكر مداري مضبوطة على 60 دورة في الدقيقة.
2. اغسل الشرائح 1x لمدة 1 دقيقة مع 50 مل من 0.01x washs buffer B في RT في وعاء Coplin. اضبط جرة Coplin على شاكر مداري مضبوطة على 60 دورة في الدقيقة. يتم تحضير هذا المخزن المؤقت عن طريق تخفيف المخزن المؤقت للغسيل B بالماء عالي النقاء.

فئة

10. تصاعد Coverslip

1. دع المخزن المؤقت للغسيل الزائد يتدفق من الشريحة على منشفة ورقية وامسح أي مخزن مؤقت متبقي على محيط الشريحة المطلي بالإيبوكسي.
2. أضف 10 ميكرولتر من وسط التركيب (جدول المواد) لأخذ عينات ووضع غطاء برفق في الأعلى ، مما يسمح بانتشار وسيط التثبيت.
3. قم بالطلاء حول حافة الغطاء بطلاء الأظافر لإغلاق الغطاء والانزلاق. كن لطيفا مع تطبيق طلاء الأظافر لتجنب تحريك الغطاء ، مما يؤدي إلى إتلاف الخطوط الجرثومة. دع طلاء الأظافر يتماسك لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT ، بينما تكون الشرائح محمية من الضوء ، قبل مشاهدتها تحت المجهر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول بارافورمالدهايد 16٪ خدمات المجهر الإلكتروني 15710 [م] تستخدم لصنع حل عمل بنسبة 4٪ 1 م كيلو ساعة₂PO4 سيغما ب0662 قم بإعداد مخزون عمل 1M 1x M9 مختلف مختلف محضرة كمخزون 10x مستخدم عند 1x ؛ انظر wormbook.org للبروتوكول 1x برنامج تلفزيوني مختلف مختلف انظر wormbook.org للبروتوكول 26.5 إبرة قياس إكسل انترناشيونال هاتف: 26402 الإبر المستخدمة للتشريح جيش صرب البوسنه لامبير 7500802 أنابيب الطرد المركزي الترمو: العلمية 05-529 ج 50 مل أنبوب الطرد المركزي من خشب البلوط يستخدم للمزامنة مجهر متحد البؤر زييس 880 ريال جرة كوبلين بولي لاب 62101 غطاء لتجميد العينة الكرة الأرضية العلمية 1411-10 22 × 40 مم ، رقم 1 Coverslip لإغلاق الشريحة الكرة الأرضية العلمية 1404-15 22 × 22 مم ، رقم 1.5 وسيط تركيب DAPI للتألق المناعي المتجه إتش-1200 ليغاز سيجما ألدريتش DUO82029 Duolink 1x Ligase ، يأتي كجزء من مجموعة الكواشف الحمراء للكشف في الموقع Duolink DUO92008 تضخيم المخزن المؤقت الأحمر سيجما ألدريتش DUO82011 المخزن المؤقت Duolink 5x Amplification Red ، يأتي كجزء من مجموعة الكواشف الحمراء للكشف عن Duolink في الموقع DUO92008 عازلة الربط سيجما ألدريتش DUO82009 المخزن المؤقت Duolink 5x Ligation ، يأتي كجزء من مجموعة الكواشف الحمراء للكشف في الموقع Duolink DUO92008 مخفف الأجسام المضادة سيجما ألدريتش DUO82008 مخفف الأجسام المضادة Duolink ، يأتي مع DUO92004 و DUO92002 ، ملاحظة: يمكن أيضا استخدام محلول 1x PBS / 1٪ BSA كبديل لتخفيف الجسم المضاد. حل الحجب سيجما ألدريتش DUO82007 حل حجب Duolink ، يأتي مع DUO92004 و DUO92002 تصاعد وسط لجيش التحرير الشعبى الصينى سيجما ألدريتش DUO82040 Duolink في الموقع تركيب وسيط مع DAPI مسبار ناقص سيجما ألدريتش DUO92004 Duolink في الموقع مسبار مضاد للماوس ناقص مسبار PLUS سيجما ألدريتش DUO92002 Duolink في الموقع مسبار مضاد للأرانب PLUS غسل المخزن المؤقت أ سيجما ألدريتش DUO82046 Duolink في الموقع غسل المخزن المؤقت A غسل العازلة ب سيجما ألدريتش DUO82048 Duolink في الموقع غسيل عازلة B البوليميراز سيجما ألدريتش DUO82030 يأتي Duolink Polymerase كجزء من مجموعة دولينك للكشف عن الكواشف الحمراء في الموقع DUO92008 مجهر epifluorescent لايكا كاميرا DFC300G ، مجهر DM5500B الماعز المضادة للفأر Alexa 594 جاكسون إيمونو 115-585-146 استخدم في الساعة 1:500 الماعز المضادة للأرانب Alexa 488 جاكسون إيمونو 111-545-144 استخدم في الساعة 1:200 ماصة زجاجية كورنينج 7095 ب -5 إكس ليفاميزول ACROS Organics 187870100 قم بإعداد مخزون عمل 250 ملي متر ميثانول فيشر ساينتيك أ 454 الماوس المضاد ل FLAG سيغما F1804 استخدم في الساعة 1: 1000 للتألق المناعي و PLA ، يوصى بالكتلة المسبقة مع مصل الماعز العادي طلاء الأظافر ألوان لوس أنجلوس CNP195 وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) مختلف انظر wormbook.org للبروتوكول مصل الماعز العادي جاكسون إيمونو 005-000-121 ماصة البولي إيثيلين باستور الكرة الأرضية العلمية هاتف: 135030 بولي L-يسين سيجما ألدريتش ص 1524 محضرة كمحلول مخزون بنسبة 0.1٪ في الماء ، مخزنة في درجة حرارة -20 درجة مئوية ، ومخففة 1: 100 في الماء لتغليف الشرائح أطباق بتري ترايتك الطراز القياسي 7060 قطر 60 مم أرنب مضاد ل GFP ثيرمو فيشر جي 10362 استخدم في 1: 200 للتألق المناعي ، 1: 4000 لجيش التحرير الشعبى الصينى الشرائح ثيرمو فيشر 30-2066A-Brown يتم طلب الشرائح القابلة للتعقيم بثلاثة مربعات مقاس 14 × 14 مم مع قضبان حسب الطلب من خلال Fisher Scientific. بولي L-يسين يضاف إلى الشرائح في المختبر محلول هيبوكلوريت الصوديوم فيشر ساينتيك SS290-1 مناديل المهام كيمتيك 34120 مناديل مبللة مقاس 4.4 × 8.4 بوصة الصواني (242 × 241 × 20 مم) ثيرمو فيشر 240845 تستخدم لصنع غرفة رطبة تريتون X-100 ACROS Organics 327372500 مياه فائقة النقاء ميلي كيو المياه فائقة النقاء التي يتم الحصول عليها من نظام تنقية المياه المتكامل Milli-Q زجاج الساعة كارولينا بيولوجيا 742300 -20 درجة مئوية فريزر -80 درجة مئوية فريزر رقائق الألومنيوم سلالة OP50 الإشريكية القولونية شاكر مداري شريط سلالات الديدان الخيطية المستخدمة في هذه الدراسة (كلاهما متاح عند الطلب) mntSi13 [pME4.1] II ؛ unc-119 (ed3) III ؛ teIs1 [pRL475] 376 يو إم تي dlc-1 حفلة موسيقية :: 3xFLAG: :d lc-1: :d lc-1 3'UTR ؛ oma-1 حفلة موسيقية :: oma-1 :: GFP ؛ المرجع 24 mntSi13 [pME4.1] II ؛ mntSi21 [pXW6.22] unc-119 (ed3) III 422 يو إم تي dlc-1 حفلة موسيقية :: 3xFLAG: :d lc-1: :d lc-1 3'UTR ؛ gld-1 حفلة موسيقية :: ceGFP :: fbf-1 3'UTR + unc-119 (+) ؛ المرجع: هذه الدراسة