هضم البروتين على الغشاء لإعداد البروتينات المترسبة المناعية المشتركة لدراسات التفاعل

الملخص

المصدر: Obama، T. et al. ، تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء.J. Vis. Exp.(2019)

يوضح هذا الفيديو مجمعات البروتين المترسبة المناعية المشتركة على غشاء PVDF لتحليل تفاعل البروتين والبروتين. تمت معالجة البروتينات المختزلة من المجمعات بالتربسين لشق البروتينات الفردية عند الببتيدات الأصغر ، ثم تم استخراج الببتيدات المتبقية من غشاء PVDF. ثم تم تجفيف الببتيد المسحوب المشتق من كلا البروتينين في المركب وإعادة تعليقه في تركيز منخفض من حمض الفورميك لمزيد من التحليل.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الترسيب المناعي

ملاحظة: استخدمنا المخزن المؤقت لتحلل كبريتات الدوديسيل غير الصوديوم (SDS) وشطف السترات ، كما هو موضح في الأقسام التالية. ومع ذلك ، فإن استخدام تقنية الترسيب المناعي البديلة الداخلية قد يكون قابلا للتطبيق أيضا لإعداد عينات LC-MS / MS.

1. الخلايا المستزرعة عبر الطبيعة بنواقل تشفر علامة حاتمة وحدها أو بروتين اندماج. للحصول على بيانات تمثيلية ، انقل خلايا J774 (1 × 10⁶) مع نواقل تشفر بروتين فلوري أخضر (GFP) وحده أو Capn6 المنصهر ب GFP (جين calpain-6) باستخدام الجسيمات الشحمية الكاتيونية.
2. اقتران الجسم المضاد للحبات المغناطيسية.
   1. لهذا الغرض ، قم بخلط الجسم المضاد المضاد ل GFP (2 ميكرولتر / تفاعل) مع حبات مغناطيسية (25 ميكرولتر / تفاعل) في 500 ميكرولتر من عازلة فوسفات السترات (24.5 ملي مولار حامض الستريك ، 51.7 ملي مولار فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة ؛ درجة الحموضة 5.0) في أنبوب اختبار 1.5 مل.
   2. قم بتدوير الخليط عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل الخرزات المترافقة IgG ثلاث مرات باستخدام عازلة فوسفات السترات التي تحتوي على 0.1٪ بولي أوكسي إيثيلين (20) أحادي لورات سوربيتان.
3. قم بتحليل الخلايا المنقولة باستخدام مخزن مؤقت مناسب للتحلل. للحصول على بيانات تمثيلية ، قم بعمل الخلايا المنقولة لمدة 30 دقيقة على الجليد في 400 ميكرولتر من محلول التحلل (50 ملي مولار Tris-HCl ؛ درجة الحموضة 7.5 ، 120 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5٪ بولي (أوكسي إيثيلين) أوكتلفينيل إيثر) تحتوي على 40 ميكرولتر / لتر فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل ، 50 ميكروغرام / مل ليوبيبتين ، 50 ميكروغرام / مل أبروتينين ، 200 ميكرولتر / لتر أورثوفانادات الصوديوم ، و 1 ملي مولار حمض رباعي الأسيتيك الإيثيلين جلايكول (EGTA) في أنابيب اختبار 1.5 مل بعد 24 ساعة من التعداد.
4. قم بمسح المحللة عن طريق الطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 5 دقائق وجمع المادة الطافية.
5. قم بمسح المحلل. أضف حبات مغناطيسية غير مسماة (25 ميكرولتر / تفاعل) في أنبوب اختبار 1.5 مل. اغسل الخرزات ثلاث مرات ب 500 ميكرولتر من محلول فوسفات السترات. بعد إزالة عازلة فوسفات السترات في الغسيل النهائي ، أضف محللة الخلية فوق الخرز المغناطيسي. قم بتدوير الخليط باستخدام دوار عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. ضع أنبوب الاختبار على حامل مغناطيسي لمدة 5 دقائق للفصل المغناطيسي ، واجمع محللة الخلية. يوصى باستخدام الحامل المغناطيسي المعين من قبل الشركة المصنعة.
7. اربط البروتينات المستهدفة بالخرز المترافق. ضع الخرزات المترافقة مع الغلوبولين المناعي (Ig) G على حامل مغناطيسي لمدة 5 دقائق للفصل المغناطيسي ، وتخلص من عازلة السترات ، ثم أضف محللة الخلية إلى الخرزات المنفصلة.
8. قم بتدوير الخليط عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
9. افصل البروتينات المستهدفة عن البروتينات الحرة غير المستهدفة. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من محلول فوسفات السترات الذي يحتوي على 0.1٪ بولي أوكسي إيثيلين (20) أحادي لورات السوربيت. بعد الغسيل النهائي ، أضف 30 ميكرولتر من عازلة السترات (درجة الحموضة 2-3) ، واحتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتصفية البروتينات المستهدفة.
   ملاحظه: إذا كان التعافي من الترسيب المناعي غير كاف ، فإن استخدام علامات الحاتمة البديلة ، مثل FLAG أو HIS ، قد يحسن الكفاءة. إذا كانت كفاءة الشطف غير كافية ، فإن استخدام مواد المسلحات الأخرى ، مثل الحل القائم على SDS ، قد يحسن الكفاءة.

< p class = "jove_title" >2. هضم البروتينات على الغشاء

ملاحظة: يعد استخدام المواد والمعدات الخالية من البروتين أمرا ضروريا لتجنب التلوث بالبروتينات الخارجية. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بأن يرتدي المشغل قناعا جراحيا وقفازات لتجنب التلوث بالبروتينات البشرية.

1. قم بتقطيع أغشية PVDF إلى قطع 3 مم × 3 مم باستخدام مقص جراحي تم مسحه بالميثانول وتجفيفه مباشرة قبل الاستخدام.
2. أضف 2-5 ميكرولتر من الإيثانول إلى قطع غشاء PVDF على رقائق الألومنيوم النظيفة.
3. قبل أن تجف تماما ، أضف المادة المزلجة (2-5 ميكرولتر لكل منهما ، 4-6 قطع لكل عينة) على أغشية PVDF المحبة للماء ، ثم جفف الأغشية بالهواء حتى يصبح سطح الغشاء غير لامع. يمكن تخزين الأغشية المجففة عند 4 درجات مئوية.
4. انقل جميع الأغشية إلى أنابيب بلاستيكية سعة 1.5 مل ، وأضف 20-30 ميكرولتر من الإيثانول لجعل الأغشية محبة للماء ، ثم قم بإزالة الإيثانول باستخدام ماصة.
5. قبل أن يجف الغشاء تماما ، أضف 200 ميكرولتر من محلول التفاعل القائم على الديثيوثريتول (DTT) (80 ملي مولار NH₄HCO₃ و 10 ملي مولار DTT و 20٪ أسيتونيتريل) واحتضنه عند 56 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
6. استبدل محلول التفاعل ب 300 ميكرولتر من محلول اليودوأسيتاميد (80 ملي مولار NH₄HCO₃ ، 55 ملي مولار يودوأسيتاميد ، و 20٪ أسيتونيتريل) ، واحتضنه لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
7. اغسل الأغشية مرتين ب 1 مل من الماء المقطر ومرة واحدة ب 1 مل من الأسيتونيتريل 2٪ عن طريق الخلط الدوامي لمدة >10 ثانية.
8. قم بإذابة التربسين المجفف بالتجميد من الدرجة MS (جدول المواد) مباشرة في محلول التفاعل (30 ملي مولار NH₄HCO₃ يحتوي على 70٪ أسيتونيتريل). أضف 100 ميكرولتر من محلول التفاعل الذي يحتوي على 1 ميكروغرام من التربسين (جدول المواد) (30 ملي مولار NH₄HCO₃ يحتوي على 70٪ أسيتونيتريل) واحتضانه عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
9. انقل محلول التفاعل الذي يحتوي على الهضم التربتسي إلى أنبوب اختبار نظيف سعة 1.5 مل باستخدام ماصة.
10. أضف 100 ميكرولتر من محلول الغسيل (70٪ أسيتونيتريل / 1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك) إلى الغشاء واحتضنه عند 60 درجة مئوية لمدة ساعتين. اجمع محلول الغسيل واخلطه مع محلول التفاعل. أضف 100 ميكرولتر أخرى من محلول الغسيل إلى الغشاء وقم بصوتته لمدة 10 دقائق. ثم اجمع محلول الغسيل واخلطه مع محلول التفاعل.
11. قم بتغطية أنبوب الاختبار بقطعة من فيلم المختبر وقم بعمل فتحتين صغيرتين بإبرة. جفف المحلول باستخدام مكثف فراغ.
12. قم بإذابة البقايا في 10 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.2٪. بعد الطرد المركزي (12,000 × جم ، 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة) ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب عينة.
    ملاحظه: الغسيل هو الخطوات الحاسمة لهذا القسم. أثناء هضم البروتين على الغشاء ، يعد غسل الأغشية التي تحتوي على البروتينات المجمدة بعد الاختزال والألكلة بالماء المقطر ، متبوعا ب 2٪ أسيتونيتريل ، لأكثر من 10 ثوان لكل منها ، أمرا بالغ الأهمية لإزالة الكواشف.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أسيتونيتريل واكو 014-00386 حامض الستريك واكو 030-05525 DTT ناكالاي تيسك 14112-94 بروتين Dynabeads G ثيرمو فيشر العلمي 10003 د حمض الفورميك واكو 066-00461 يودوأسيتاميد واكو 095-02151 ليبوفيكتامين 3000 ثيرمو فيشر العلمي L3000008 الألوان الحية A.v. الجسم المضاد أحادي النسيلة (JL-8) كلونتك 632380 كلوريد الصوديوم واكو 191-01665 NH₄HCO₃ واكو 018-21742 نونيدت ب -40 سيغما رقم 6507 بولي (أوكسي إيثيلين) أوكتيل فينيل الأثير (ن = 9) كوكتيل مثبط البروتياز سيغما ص 8465 تسلسل الصف المعدل Trypsin بروميجا في 5111 التربسين أورثوفانادات الصوديوم سيغما S6508 ثنائي هيدرات فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سيغما 71643 TFA واكو 206-10731 تريس واكو هاتف: 207-06275 توين 20 واكو 160-21211