$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. ترطيب المستشعر الحيوي وإعداد الفحص
- قم بتشغيل آلة BLItz.
- تأكد من توصيل الجهاز بالكمبيوتر من خلال منفذ إخراج بيانات USB في الجزء الخلفي من الجهاز.
- على الكمبيوتر ، افتح البرنامج المرتبط (على سبيل المثال ، BLItz Pro) ، وانقر فوق Advanced Kinetics على الجانب الأيسر من الشاشة.
- في البرنامج ، اكتب جميع المعلومات المناسبة حول التجربة (بما في ذلك اسم التجربة والوصف ومعرف العينة وتركيز البروتين) تحت كل عنوان على حدة.
- انقر فوق Biosensor Type واختر Ni-NTA من القائمة المنسدلة.
- ضمن عنوان إعدادات التشغيل، تحقق من تعيين Shaker على تمكين.
- ضمن عنوان قائمة نوع الخطوة، تحقق من وجود 5 عناصر مدرجة: الأساس الأولي، والتحميل، والخط الأساس، والاقتران، والتفكك.
ملاحظه: يمكن تغيير مدة كل خطوة من الافتراضي حسب الحاجة. للحصول على أفضل النتائج ، استخدم ما لا يقل عن 30 ثانية لخط الأساس الأولي وخط الأساس. و 120 ثانية للارتباط والانفصال. تعتمد مدة خطوة التحميل (التي تتراوح من 120 إلى 240 ثانية) على تركيز الترابط وتقارب علامة His-epitope على الترابط إلى المستشعر الحيوي Ni-NTA.
- قم بإزالة المستشعر الحيوي Ni-NTA المرطب من أنبوب PCR وتثبيته على حامل المستشعر الحيوي على الجهاز عن طريق تحريك الجزء العريض من المستشعر الحيوي على الحامل.
ملاحظه: لا تدع المستشعر الحيوي يجف أثناء التجربة.
- ضع أنبوب طرد مركزي أسود سعة 0.5 مل في حامل أنبوب الماكينة وقم بإدخال 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت BLI فيه.
- تحقق من وضع شريط تمرير الجهاز بحيث يكون حامل الأنبوب أمام السهم الأسود على الجهاز.
- أغلق غطاء الجهاز بحيث يصبح طرف المستشعر الحيوي مغمورا في المخزن المؤقت في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
- انقر فوق التالي على البرنامج لبدء تسجيل خط الأساس الأولي.
< p class = "jove_title" >2. تحميل الترابط على المستشعر الحيوي
- بعد انتهاء التسجيل من خطوة خط الأساس الأولي ، افتح غطاء الجهاز.
- حرك شريط التمرير إلى اليمين بحيث يكون حامل الإسقاط (بدلا من حامل الأنبوب) أمام السهم الأسود.
- ماصة 4 ميكرولتر من ترابط His-tagged المسبب للغسيل على حامل السقوط وأغلق غطاء الماكينة.
ملاحظة: قد يختلف التركيز الأمثل للترابط المراد استخدامه لكل بروتين. عادة ما يكون التركيز بين 1.0 إلى 2.0 مجم / مل كافيا لتشبع NTA عند طرف المستشعر الحيوي في 240 ثانية.
- في البرنامج، انقر فوق التالي لبدء التحميل.
3. غسل الترابط الإضافي
- بعد انتهاء خطوة التحميل من التسجيل، افتح غطاء الجهاز.
- حرك شريط التمرير إلى اليسار بحيث يكون حامل الأنبوب موجودا مرة أخرى أمام السهم الأسود.
- أغلق غطاء الماكينة وتأكد من غمر طرف المستشعر الحيوي في المخزن المؤقت BLI للأنبوب الموجود في حامل الأنبوب.
- انقر فوق التالي مرة أخرى على البرنامج لبدء تسجيل خط الأساس.
< p class = "jove_title" >4. ارتباط التحليل بالليجند
- بعد انتهاء خطوة Baseline من التسجيل، افتح غطاء الجهاز.
- قم بإزالة حامل القطرات ونظفه عن طريق إخراج أي بروتين وشطفه بالماء منزوع الأيونات المزدوج (ddH2O) لمدة 5 مرات.
- استخدم مناديل مناديل لتنظيف سطح حامل القطرات بعد الغسيل.
- أعد تركيب حامل السقوط مرة أخرى على الجهاز.
- حرك شريط التمرير الموجود على الجهاز إلى اليمين بحيث يكون حامل الإسقاط موجودا مرة أخرى أمام السهم الأسود.
- ماصة 4 ميكرولتر من مادة تحليلية مكسورة بالكلى على حامل السقوط وأغلق غطاء الماكينة.
- في البرنامج، انقر فوق التالي لبدء الاقتران.
< p class = "jove_title" >5. تفكك التحليل عن الترابط
- بعد الانتهاء من خطوة الاقتران ، افتح غطاء الجهاز.
- حرك شريط التمرير الموجود على الجهاز إلى اليمين بحيث يكون حامل الأنبوب موجودا مرة أخرى أمام السهم الأسود.
- في البرنامج، انقر فوق التالي لبدء التفكك.
- بعد انتهاء خطوة التفكيك من التسجيل ، افتح غطاء الجهاز.
- قم بإزالة حامل السقوط وحامل الأنبوب.
- اشطف كلاهما باستخدام ddH2O جيدا لغسل أي بروتين.
- قم بإزالة المستشعر الحيوي وتخلص منه بأمان.