التحليل الطيفي لتذبذب التألق لدراسة تفاعل البروتين في ملامسات الخلية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Dunsing، V. et al. مقايسة التحليل الطيفي لتذبذب التألق لتفاعلات البروتين والبروتين في جهات اتصال الخلية الخلوية. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو استخدام التحليل الطيفي لتذبذب التألق للكشف عن التفاعل بين بروتينات سطح الخلية عند ملامسة الخلية الخلوية. من خلال التعبير عن مستقبل الالتصاق عبر الغشاء ذي الأهمية المسمى ببروتين الفلورسنت وخلط مجموعتين مختلفتين من الخلايا التي تحتوي على ملصقين فلوريين منفصلين طيفيا ، يتم تقييم التفاعل العابر بين مستقبلات خليتين متجاورتين بألوان مختلفة من خلال الارتباط المتبادل في تقلبات شدة التألق

.

البروتوكول

p class = "jove_title" >1. تحضير العينة: فحص خلط الخلية والخلية

ملاحظة: يصف البروتوكول التالي إجراء الخلط للخلايا الملتصقة. يمكن تعديله للخلايا المزروعة في التعليق.

1. قم بزرع عدد مناسب من الخلايا على صفيحة مكونة من 6 آبار ، على سبيل المثال ، 800,000 خلية HEK 293T (يتم احتسابها بغرفة عد Neubauer) ، قبل يوم واحد من التعدين. يمكن تعديل الرقم اعتمادا على الوقت بين البذر والتعداء وتعديله لأنواع الخلايا الأخرى. لإجراء تجربة أساسية (أي البروتينات ذات الأهمية والتحكم السلبي) ، قم بإعداد 4 آبار على الأقل. خلايا مزرعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ، مكمل بمصل الأبقار الجنينية (10٪) و L-glutamine (1٪).
2. الخلايا الشفافة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
   1. لإجراء تجربة أساسية ، يتم دمج البلازميدات للبروتين ذي الأهمية في آبار منفصلة في بروتين "أخضر" (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز الأحادي (mEGFP) ، أو البروتين الفلوري الأصفر (mEYFP)) أو البروتين الفلوري "الأحمر" (على سبيل المثال ، mCherry ، أو mCardinal><). ملاحظه: في هذا البروتوكول ، نركز على APLP1-mEYFP و APLP1-mCardinal ، والتحكم السلبي المقابل ، على سبيل المثال ، myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) و -mCardinal (myr-palm-mCardinal). بشكل عام ، يكفي 200 نانوغرام - 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد. تزيد كفاءة التعداء العالية من فرصة العثور على خلايا "حمراء" و "خضراء" على اتصال. قم بتعديل كمية الكاشف البلازميد والتعدي لتحسين كفاءة التعداد. حرج: يجب أن يكون التقاء الخلايا حوالي 70٪ عند نقل الخلايا. إذا كانت الخلايا شديدة التقاء ، فستنخفض كفاءة التعداد. إذا لم تكن الخلايا ملتصقة بدرجة كافية ، فقد يؤدي التعدي والاختلاط إلى الإجهاد ويمنع العديد من الخلايا من الارتباط بشكل صحيح بعد الخلط.
3. قم بخلط الخلايا ~ 4 ± 2 ساعة بعد التعداد.
   1. قم بإزالة وسط النمو وغسل كل منهما جيدا برفق باستخدام 1 مل PBS مكمل ب Mg²⁺ و Ca²⁺. ثم قم بإزالة PBS. (حرج) قم بإسقاط PBS على حافة البئر لمنع انفصال الخلايا أثناء الغسيل.
   2. أضف ~ 50 ميكرولتر من محلول حمض التريبسين إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) إلى كل بئر لتسهيل انفصال الخلايا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، رج الصفيحة المكونة من 6 آبار ببطء بشكل جانبي لفصل الخلايا.
      ملاحظه: قد تكون هناك حاجة إلى أوقات حضانة ممتدة لبعض أنواع الخلايا.
   3. أضف 950 ميكرولتر من وسط النمو إلى كل بئر وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات عدة مرات لأعلى ولأسفل ، وبالتالي فصل جميع الخلايا عن قاع البئر. (حرج) تأكد من إعادة تعليق الخلايا بشكل صحيح وفصلها عن بعضها البعض عن طريق التحقق بصريا من عدم وجود مجاميع خلايا كبيرة بعد إعادة التعليق. خلاف ذلك ، سيتم الحصول على العديد من جهات الاتصال "الحمراء" - "الحمراء" أو "الخضراء" - "الخضراء" بعد الخلط.
   4. انقل محلول الخلية لبئر واحد (بروتين ذي أهمية أو تحكم سلبي) إلى البئر المقابل ، أي "أحمر" (على سبيل المثال ، APLP1-mCardinal transfected) إلى خلايا "خضراء" (على سبيل المثال ، APLP1-mEYFP transfected). امزج عن طريق سحب العينات برفق عدة مرات لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا المختلطة على أطباق قاع زجاجية مقاس 35 مم (1 مل من محلول الخلايا المختلطة لكل طبق ، بالإضافة إلى 1 مل من وسط النمو) وزرع الخلايا المصنفة ليوم آخر عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

2. إعداد العينة: التحكم الإيجابي في تجارب الارتباط المتبادل وبناء الثنائي المتماثل لتحليل السطوع

1. بذرة 600,000 HEK 293T خلية ، معدودة بغرفة عد الخلايا ، على أطباق زجاجية قاع مقاس 35 مم قبل يوم واحد من التعداد. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في وسط DMEM كامل (انظر الخطوة 1.1) ليوم آخر.
2. الخلايا الشفافة مع ~ 250 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. للتحكم في الارتباط المتبادل الإيجابي ، استخدم بلازميد يشفر بروتين فلوري غير متجانس مثبت بالغشاء ، على سبيل المثال ، myr-palm-mCherry-mEGFP أو myr-palm-mCardinal-mEYFP المقابلة ل FPs للبروتين محل الاهتمام. لمعايرة السطوع ، استخدم البلازميدات التي تشفر كلا من مونومر FP المثبت بالغشاء والثنائي المتجاني المقابل ل FPs المدمجة في البروتين محل الاهتمام ، على سبيل المثال ، myr-palm-mEYFP و myr-palm-mEYFP-mEYFP لمعايرة تحليل سطوع APLP1-mEYFP.
3. خلايا الزراعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في وسط DMEM كامل (انظر الخطوة 1.1) ليوم آخر.

فئة

3. الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر: الإعداد ومعايرة الحجم البؤري

ملاحظة: تمت كتابة البروتوكول التالي للتجارب التي أجريت باستخدام mEGFP / mEYFP و mCherry / mCardinal على المجهر متحد البؤر للمسح بالليزر المستخدم في هذه الدراسة. يمكن تعديل الإعداد البصري وإعدادات البرنامج (خطوط الليزر والمرايا ثنائية اللون والمرشحات) واختيار أصباغ المعايرة لإعدادات FPs والمجهر الأخرى.

1. قم بتشغيل المجهر والليزر قبل ساعة على الأقل من التجربة لضمان استقرار الليزر وتوازن درجة الحرارة.
2. قم بإعداد 100-200 ميكرولتر من محاليل الصبغة الفلورية المناسبة القابلة للذوبان في الماء (انظر جدول المواد للحصول على أمثلة) في الماء أو PBS لمعايرة الحجم البؤري ، بتركيزات في نطاق 10-50 نانومتر.
3. ضع محاليل الصبغة على طبق زجاجي نظيف مقاس 35 مم # 1.5 ، أي بسمك 0.16-0.19 مم
   ملاحظه: من الناحية المثالية ، استخدم الأطباق ذات الزجاج عالي الأداء الذي يتميز بتحمل منخفض السماكة ، على سبيل المثال ، 0.170 ± 0.005 مم ، مما يسمح بتصحيح حلقة الياقة الأمثل (الخطوة 3.6). من المهم استخدام نفس نوع الطبق كما هو مستخدم لاحقا للتجارب التالية.
4. ضع الطبق الذي يحتوي على محلول الصبغة مباشرة على الهدف (يفضل الغمر في الماء ، مع NA 1.2) لضمان التركيز في المحلول. بدلا من ذلك ، ضع الطبق على حامل العينة وركز على العينة (على سبيل المثال ، 10-20 ميكرومتر فوق قاع الطبق).
   ملاحظة: لا نوصي باستخدام أهداف الزيت بسبب ضعف الإشارة التي تم الحصول عليها عند التركيز بعمق في العينات المائية.
5. قم بإعداد مسار الإثارة والانبعاث ، على سبيل المثال ، اختر ليزر 488 نانومتر ، ومرآة ثنائية اللون 488/561 نانومتر ، ونافذة كشف 499-552 نانومتر ، وحجم ثقب 1 وحدة Airy (AU). تأكد من أن حجم الثقب هو نفس الحجم الذي سيتم استخدامه في قياسات الارتباط المتبادل.
6. اضبط موضع الثقب (ضبط الثقب) وحلقة الياقة الموضوعية لزيادة معدل العد. لهذا الهدف ، أدر حلقة الياقة حتى يتم اكتشاف الحد الأقصى لمعدل العد.
   ملاحظه: يمثل تصحيح حلقة الياقة السماكة المحددة لزجاج الغطاء المستخدم. يعد تعظيم معدل العد ، أي جمع أكبر عدد ممكن من الفوتونات لكل جزيء ، أمرا بالغ الأهمية لتعظيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) للقياسات.
7. قم بإجراء سلسلة من قياسات FCS النقطية (على سبيل المثال ، 6 قياسات في مواقع مختلفة ، يتكون كل منها من 15 تكرارا لمدة 10 ثوان ، أي 2.5 دقيقة من الوقت الإجمالي ، تم أخذ عينات بوقت سكون 1 ميكرو ثانية أو أقل) بنفس طاقة الليزر المستخدمة في قياسات الارتباط المتبادل (عادة ~ 1٪ ، أي ~ 1-2 ميكروواط).
8. قم بتركيب نموذج انتشار ثلاثي الأبعاد بما في ذلك مساهمة ثلاثية (المعادلة 1) للبيانات.
   
   ملاحظه: عادة ما تكون أوقات الانتشار التي تم الحصول عليها حوالي 30 ميكرو ثانية وعامل الهيكل حوالي 4-8.
9. احسب الخصر w₀ من متوسط وقت الانتشار المقاس والقيم المنشورة لمعامل انتشار الصبغة المستخدمة في درجة حرارة الغرفة وفقا للمعادلة 2.
   
   القيم النموذجية هي 200-250 نانومتر.
10. كرر روتين المعايرة (الخطوات 3.4-3.9) بصبغة فلورية مختلفة لقناة كشف ثانية إذا لزم الأمر (على سبيل المثال ، إثارة 561 نانومتر والكشف بين 570 نانومتر و 695 نانومتر). حافظ على موضع الثقب وحجمه كما تم ضبطه لقناة الكشف الأولى.
11. احسب السطوع الجزيئي (المعادلة 3) من قياسات المعايرة ، وقم بتخزين القيم التي تم الحصول عليها.
    
    ملاحظه: القيم النموذجية للإعداد المستخدم هي ~ 8-10 كيلو هرتز / جزيء (MOL) لقوة إثارة 1.8 ميكروواط 488 نانومتر. قد تشير القيم الأقل من المعتاد إلى وجود أوساخ على الهدف أو عدم محاذاة الإعداد أو انخفاض خرج الليزر. افحص وقم بتخزين قوى إخراج الليزر في الهدف بانتظام باستخدام عداد الطاقة. للمقارنة بين الإعدادات المختلفة ، فإن السطوع الجزيئي الذي يتم تطبيعه بواسطة قوة ليزر الإثارة هو المعلمة الأكثر أهمية لتقييم أداء المجهر.

< p class = "jove_title" >4. التحليل الطيفي للارتباط المتبادل للمسح الضوئي: الاستحواذ

ملاحظة: تمت كتابة البروتوكول التالي للتجارب التي أجريت باستخدام mEGFP / mEYFP ("أخضر") و mCherry / mCardinal ("أحمر") على المجهر متحد البؤر للمسح بالليزر المستخدم في هذه الدراسة. قد يختلف الإعداد البصري وإعدادات البرنامج (خطوط الليزر والمرايا ثنائية اللون والمرشحات) باختلاف FPs أو إعدادات المجهر الأخرى.

1. قم بإعداد المسار البصري ، على سبيل المثال ، إثارة 488 نانومتر و 561 نانومتر ومرآة ثنائية اللون 488/561 نانومتر ، ثقب على 1 وحدة فلكية لإثارة 488 نانومتر. لتجنب الحديث الطيفي ، حدد مسارين منفصلين لإثارة واكتشاف mEGFP / mEYFP (إثارة 488 نانومتر ، قناة خضراء) و mCherry / mCardinal (إثارة 561 نانومتر ، قناة حمراء) بالتتابع وحدد مسارات التبديل لكل سطر. وللكشف ، استخدم المرشاح المناسبة لكلتا القناتين ، على سبيل المثال ، 499-552 نانومتر في القناة الخضراء و 570-695 نانومتر في القناة الحمراء.
2. إذا لم يكن الإثارة المتناوبة ممكنة ، فاستخدم إعدادات المرشح المناسبة للقناة الحمراء لتقليل الحديث الطيفي (أي اكتشاف تألق mCherry / mCardinal لا يقل عن 600 نانومتر). قد يقلل هذا من كمية الفوتونات المكتشفة في القناة الحمراء وبالتالي يقلل من SNR.
3. ضع الطبق الذي يحتوي على الخلايا المختلطة على حامل العينة. انتظر 10 دقائق على الأقل لضمان توازن درجة الحرارة وتقليل انحراف التركيز البؤري.
4. ركز على الخلايا باستخدام ضوء الإرسال في قائمة تحديد الموقع.
5. ابحث عن زوج من الخلايا "الحمراء" و "الخضراء" على اتصال ببعضهما البعض. للارتباط المتبادل الإيجابي أو التحكم في سطوع homo-dimer (انظر القسم 2) ، ابحث عن خلية معزولة تنبعث منها مضان في كلتا القناتين أو إشارة homo-dimer المعنية في PM.
   ملاحظة: (حرج) قلل من التعرض للعينة أثناء البحث عن الخلايا لتجنب التبييض المسبق ، مما قد يقلل من الارتباط المتبادل. لذلك ، قم بالمسح الضوئي بأسرع سرعة مسح وبقوى ليزر منخفضة. لتجنب تشبع الكاشف أثناء تصوير الخلايا الشفطرة بقوة ، ابحث في وضع التكامل. ومع ذلك ، لتقليل التعرض ، يمكن المسح بقوى ليزر منخفضة في وضع عد الفوتونات.
6. حدد مسار مسح عمودي على ملامسة الخلية الخلوية (أو إلى PM لخلية واحدة للارتباط المتبادل الإيجابي أو التحكم في سطوع الختان المتجانس) باستخدام زر الاقتصاص كما هو موضح في الشكلين 1B و 2A.
   ملاحظه: لا تسمح بعض المجاهر القديمة باتجاهات المسح التعسفية. في هذه الحالة ، يجب تحديد ملامسات الخلية ذات الاتجاه العمودي على اتجاه الفحص.
7. قم بالتكبير لتحقيق حجم بكسل يتراوح بين 50 و 200 نانومتر وحدد الخط في وضع المسح الضوئي. اضبط حجم الإطار على 128 × 1 بكسل.
   ملاحظه: حجم البكسل النموذجي هو 160 نانومتر ، وهو ما يتوافق مع طول المسح حوالي 20 ميكرومتر.
8. اضبط سرعة المسح الضوئي على الحد الأقصى للقيمة المسموح بها، على سبيل المثال، 472.73 ميكرو ثانية لكل سطر.
   ملاحظه: بالنسبة لمخطط الإثارة البديل ، يتوافق هذا مع وقت المسح 954.45 ميكرو ثانية ، أي ~ 1000 مسح / ثانية على الإعداد المستخدم. يمكن ضبط سرعة المسح اعتمادا على معامل انتشار البروتين محل الاهتمام. بالنسبة للبروتينات المثبتة بالغشاء ، تتراوح أوقات الانتشار النموذجية حوالي 10-20 مللي ثانية. يجب أن يكون وقت المسح أصغر بعشر مرات على الأقل من أوقات الانتشار. قد تؤدي سرعات المسح المنخفضة إلى تبييض ضوئي أقوى وتتطلب قوى إضاءة أقل. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أن يفرض مؤقتا ، على سبيل المثال ، 5 مللي ثانية ، بين كل مسح بحثا عن مجمعات منتشرة ببطء شديد باستخدام الفاصل الزمني في القائمة الفرعية للسلسلة الزمنية.
9. اختر قوى الليزر المناسبة ، على سبيل المثال ، ~ 1-2 ميكروواط ل 488 نانومتر و ~ 5-10 ميكروواط لإثارة 561 نانومتر><. ملاحظه: تعمل قوى الليزر الأعلى على تحسين SNR ، ولكنها تزيد من التبييض الضوئي. لذلك ، يجب اختيار قوى الليزر بحيث يكون التبييض الضوئي أقل من 50٪ من معدل العد الأولي.
10. اضبط الدورات على 100,000-500,000.
    ملاحظه: قد يختلف عدد عمليات المسح ، أي مدة القياس: ستعمل أوقات القياس الأطول على تحسين SNR وقد تكون أكثر ملاءمة للجزيئات المنتشرة ببطء ، ومع ذلك ، فإن حركة الخلايا والتبييض الضوئي يحدان من وقت القياس الأقصى. تم الحصول على البيانات المقدمة هنا بشكل روتيني لمدة ~ 3-6 دقائق ، أي 200,000-400,000 مسح خطي.
11. اضبط أجهزة الكشف على وضع عد الفوتونات. اضغط على بدء التجربة لبدء الاستحواذ. كرر الخطوات 4.5-4.11 لقياس خلية أخرى.
    ملاحظه: يوصى بقياس 10-15 خلية لكل عينة بمستويات تعبير مختلفة. (حرج) تجنب تشبع الكاشف عند مستويات التعبير العالية. يجب ألا يتجاوز الحد الأقصى لمعدل العد ~ 1 ميجاهرتز.
12. إذا تم إجراء تحليل السطوع لتحديد حالات قلة القلة ، فقم بإجراء قياسات معايرة سطوع الثنائي المتماثل وفقا للخطوات المعدلة 4.1-4.11: قم بقياس كل بروتين فلوري homo-dimer على حدة (في الخلايا المعزولة ، المعدة باستخدام قسم البروتوكول 2) وقم بإجراء القياسات فقط في قناة طيفية واحدة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. سير العمل التجريبي والتمثيل التخطيطي للتحليل الطيفي للارتباط المتبادل الفلوري الماسح وعدد الارتباط المتبادل وتحليل السطوع في ملامسات الخلية الخلوية. (أ) مخطط تحضير العينة: يتم خلط مجموعتين من الخلايا المنقولة بالبروتين محل الاهتمام (على سبيل المثال ، APLP1) مدمجة في بروتينين فلوريين متميزين طيفيا (على سبيل المثال ، mEYFP و mCardinal) بعد التعدين. يتم اختيار جهات ا...

المواد