مقايسة الترسيب المناعي لدراسة تفاعلات مستقبلات الإنزيم في الخلايا المنقولة

الملخص

المصدر: Strazza, M., et al. مقايسة الترسيب المناعي المشترك لدراسة التفاعلات الوظيفية بين المستقبلات والإنزيمات. J. Vis. Exp. (2018).

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية لإجراء الترسيب المناعي المشترك لبروتينات PD-1 من النوع البري والمتحور الموسومة ب GFP باستخدام حبات مغلفة بأجسام مضادة مضادة ل GFP. يتم تحضين بروتينات PD-1-GFP المرتبطة بالخرزة ببروتينات SHP2 التي تتفاعل مع PD-1 ، مما يتيح تحديد الزخارف الهيكلية المحددة في PD-1 التي تلعب دورا مهما في تفاعل SHP2.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الترسيب المناعي

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية على الجليد أو عند 4 درجات مئوية.

1. استكمل المخزن المؤقت للتحلل (50 ملي مولار Tris-HCl عند درجة الحموضة 7.2 ، 250 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ NP-40 ، 2 ملي EDTA ، 10٪ جلسرين) بمثبطات البروتياز (قم بإذابة قرص واحد في 10 مل من محلول التحلل) وب 1 ملي من أورثوفانادات الصوديوم. أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل المثلج البارد إلى الخلايا وقم بإزالة الخلايا وجمعها من الألواح على الفور باستخدام مكشطة الخلايا.
   ملاحظه: من المهم إضافة أورثوفانادات الصوديوم فقط إلى المخزن المؤقت للتحلل الذي سيتم استخدامه لألواح PD-1-GFP المنقولة لأن الألواح المن....

النتائج

الشكل 1: الظروف التجريبية والاستراتيجية. تم التعبير عن GFP-PD-1 WT (النوع البري) أو GFP-PD-1 Y223F (متحولة ITIM) أو GFP-PD-1 Y248F (متحولة ITSM) في خلايا HEK 293T التي تمت معالجتها لاحقا بالبيرفاناديت. تم خلط بروتينات GFP-PD-1 المفسفرة التي تم جمعها بواسطة الترسيب المناعي GFP مع المحللات من الخلايا التي تفرط في التعبير عن SHP2 ، وتم تسجيل مستويات ونشاط SHP2 المرتبط بكل إصدار من PD-1.

....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أغشية النيتروسليلوز جنرال إلكتريك 10600004 أجهزة الطرد المركزي الدقيقة إيبندورف 5424-ص 1.5 مل BCA صياد هاتف: 23225 فحص حمض بي سينكونينيك مضاد ل SHP2 سانتا كروز SC-280 مكافحة GFP-agarose MBL د153-8 مكافحة GFP روش 118144600 مضاد للأكتين سانتا كروز SC-1616 خلايا HEK-293 ATCC [رل-1573] أورثوفانادات سيغما S6508 كوكتيل مثبط البروتياز روش 11836170001 خالية من EDTA عينة Tris-Glycine SDS Buffer (2x) إنفيتروجين ال سي 2676 عازلة Laemmli المعدلة 4-20٪ Tris-Glycine جل صغير إنفيتروجين XP04205BOX 15 بئر التربسين EDTA (0.25٪) فينول أحمر جيبكو 25200114 كلوريد الصوديوم سيغما إس 7653 كلوريد الصوديوم