مقايسة الترسيب المناعي لدراسة تفاعلات مستقبلات الإنزيم في الخلايا المنقولة

الملخص

المصدر: Strazza, M., et al. مقايسة الترسيب المناعي المشترك لدراسة التفاعلات الوظيفية بين المستقبلات والإنزيمات. J. Vis. Exp. (2018).

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية لإجراء الترسيب المناعي المشترك لبروتينات PD-1 من النوع البري والمتحور الموسومة ب GFP باستخدام حبات مغلفة بأجسام مضادة مضادة ل GFP. يتم تحضين بروتينات PD-1-GFP المرتبطة بالخرزة ببروتينات SHP2 التي تتفاعل مع PD-1 ، مما يتيح تحديد الزخارف الهيكلية المحددة في PD-1 التي تلعب دورا مهما في تفاعل SHP2.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الترسيب المناعي

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية على الجليد أو عند 4 درجات مئوية.

1. استكمل المخزن المؤقت للتحلل (50 ملي مولار Tris-HCl عند درجة الحموضة 7.2 ، 250 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ NP-40 ، 2 ملي EDTA ، 10٪ جلسرين) بمثبطات البروتياز (قم بإذابة قرص واحد في 10 مل من محلول التحلل) وب 1 ملي من أورثوفانادات الصوديوم. أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل المثلج البارد إلى الخلايا وقم بإزالة الخلايا وجمعها من الألواح على الفور باستخدام مكشطة الخلايا.
   ملاحظه: من المهم إضافة أورثوفانادات الصوديوم فقط إلى المخزن المؤقت للتحلل الذي سيتم استخدامه لألواح PD-1-GFP المنقولة لأن الألواح المنقولة SHP2 وألواح التحكم غير المنقولة يجب أن تحتفظ بنشاط الفوسفاتيز.
2. انقل المحللات إلى أنابيب باردة سعة 1.5 مل وقم بتدويرها عند 0.005 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. لجمع المادة الطافية بعد النوى (PNS) من المحللات ، قم بتدوير المحللات لمدة 10 دقائق عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية وانقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة. تخلص من الحبيبات. قم بتخزين المواد الطافية للمجموعة الثانية المكونة من ستة صفائح (الشكل 1) على الجليد لتحليل محللة الخلية الكاملة لاحقا.
4. تحضير الخرز المضاد ل GFP للترسيب المناعي ل PD-1-GFP من المحللات المنقولة PD-1-GFP للمجموعة الأولى (أربع لوحات) (الشكل 1).
   1. لمنع استقرار الخرزات ، رج الزجاجة برفق مع الخرز قبل الفتح. قم بإزالة 40 ميكرولتر من الخرز المضاد ل GFP من الملاط لكل حالة.
   2. قم بالدوران عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية لغسل الخرز.
      ملاحظه: من المهم تقليل التلامس بين أطراف الماصة البلاستيكية وخرز الاغاروز لمنع الخسارة. يوصى بقطع حافة طرف 200 ميكرولتر قبل نقل الخرزات إلى أنبوب آخر.
   3. أعد تعليق الخرزات في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل (لكل عينة).
5. أضف الخرزات المغسولة مباشرة إلى محللة الخلية (PNS) من الخلايا التي تعبر عن PD-1-GFP للمجموعة الأولى (أربع لوحات) (الخطوة 1.3). قم بالتدوير عند 0.005 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لترسيب البروتينات التي تحمل علامة GFP المناعية.
6. اغسل الخرزات ب 1 مل من محلول التحلل البارد (بدون أورثوفاناديت) 3 مرات. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 2,500 × جم لمدة 10 ثانية < / > ملاحظه: عند إضافة المخزن المؤقت للتحلل إلى الخرزات ، أضفه مباشرة على الخرزات دون لمسها بالنصائح. ليست هناك حاجة للماصة لأعلى ولأسفل أثناء الغسيل.
7. وبالمثل ، اقسم محللة SHP2 النشطة من المجموعة الأولى (لوحة واحدة ؛ الخطوة 1.3) وأضفها إلى ثلاثة أنابيب من الخرز المغسول المحتوي على PD-1-GFP (WT PD-1-GFP وطفرتين مختلفتين ناقصتين في الفوسفو ، Y223F و Y248F). أضف ثلث الحجم من محللة الخلايا غير المنقولة إلى الأنبوب الثاني من حبات WT PD-1-GFP. تجاهل الثلثين المتبقيين.
8. احتضان الخرزات لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية مع دوران لطيف (0.005 × جم).
9. اغسل الخرزات مرتين ب 1 مل من محلول التحلل البارد (بدون بيرفاناديت أو أورثوفاناديت) ، كما هو مذكور في الخطوة 1.6.
10. أضف 80 ميكرولتر من محلول التحلل (بدون بيرفاناديت أو أورثوفاناديت) لكل عينة مع التأكد من أن الحجم الإجمالي في كل أنبوب هو 100 ميكرولتر (20 ميكرولتر من الخرز و 80 ميكرولتر من محلول التحلل). تخلط بلطف وتنقل 50 ميكرولتر من كل أنبوب إلى أنبوبين جديدين سعة 1.5 مل.
    ملاحظه: بعد هذه الخطوة ، سيكون هناك أنبوبان مملوءان بخليط يحتوي على خرز ومخزن مؤقت للتحلل. سيتم استخدام أحد الأنابيب لاختبار SHP2 المترسب المناعي المشترك عن طريق النشاف الغربي.

< p class = "jove_title" >2. SHP2 تحليل اللطخة الغربية

1. قم بتدوير الخرز وإزالة المادة الطافية.
2. أضف 20 ميكرولتر من 2x Laemmli المؤقت (انظر جدول المواد) إلى الخرز واتركه يغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. قم بقياس تركيز البروتين لعناصر التحكم في الإدخال (المجموعة الثانية) باستخدام مجموعة BCA (انظر جدول المواد). انقل 30 ميكرولتر من العينة المخففة إلى أنبوب جديد. قم بتخفيف باقي أدوات التحكم في الإدخال باستخدام عازلة التحلل إلى نفس تركيز العينة الأكثر تخفيفا وانقل 30 ميكرولتر من كل منها إلى أنبوب جديد.
   ملاحظه: بعد هذه الخطوة ، سيكون هناك 4 أنابيب بسعة 30 ميكرولتر لكل منها ، بتركيزات بروتينية مماثلة ، تمثل محللات التحكم في الإدخال.
4. أضف كميات متساوية من 2x Laemmli buffer إلى المحللات واغليها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قم بتدوير الخرز وقم بتحميل المادة الطافية على 4-20٪ من الجل القائم على تريس SDS-PAGE (انظر جدول المواد) لتحليل اللطخة الغربية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتحميل 50 ميكرولتر من كل عينة من المجموعة الثانية.
5. استمر في تحليل اللطخة الغربية.

النتائج

الشكل 1: الظروف التجريبية والاستراتيجية. تم التعبير عن GFP-PD-1 WT (النوع البري) أو GFP-PD-1 Y223F (متحولة ITIM) أو GFP-PD-1 Y248F (متحولة ITSM) في خلايا HEK 293T التي تمت معالجتها لاحقا بالبيرفاناديت. تم خلط بروتينات GFP-PD-1 المفسفرة التي تم جمعها بواسطة الترسيب المناعي GFP مع المحللات من الخلايا التي تفرط في التعبير عن SHP2 ، وتم تسجيل مستويات ونشاط SHP2 المرتبط بكل إصدار من PD-1.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أغشية النيتروسليلوز جنرال إلكتريك 10600004 أجهزة الطرد المركزي الدقيقة إيبندورف 5424-ص 1.5 مل BCA صياد هاتف: 23225 فحص حمض بي سينكونينيك مضاد ل SHP2 سانتا كروز SC-280 مكافحة GFP-agarose MBL د153-8 مكافحة GFP روش 118144600 مضاد للأكتين سانتا كروز SC-1616 خلايا HEK-293 ATCC [رل-1573] أورثوفانادات سيغما S6508 كوكتيل مثبط البروتياز روش 11836170001 خالية من EDTA عينة Tris-Glycine SDS Buffer (2x) إنفيتروجين ال سي 2676 عازلة Laemmli المعدلة 4-20٪ Tris-Glycine جل صغير إنفيتروجين XP04205BOX 15 بئر التربسين EDTA (0.25٪) فينول أحمر جيبكو 25200114 كلوريد الصوديوم سيغما إس 7653 كلوريد الصوديوم