Method Article

طريقة قائمة على ELISA لتحليل التفاعلات بين بروتينات الطعم والفريسة

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Singh ، B. et al. ، فحوصات لدراسة دور الفيترونكتين في الالتصاق البكتيري ومقاومة المصل. J. Vis. Exp. (2018)

يصف هذا الفيديو تقنية قائمة على ELISA تكتشف تفاعلات البروتين والبروتين بين بروتينين عن طريق قياس ارتباط البروتين الثاني بالبروتين الأول الثابت. يتم الكشف عن البروتين الثاني المرتبط باستخدام أجسام مضادة محددة مصنفة بإنزيم ، مثل بيروكسيداز الفجل.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تحليل ELISA للتفاعل بين الأس الهيدروجيني المؤتلف و Vn

ملاحظة: يجب تضمين عناصر التحكم لاستبعاد الربط غير المحدد. يتم استخدام العامل البشري H (FH) أو البروتين المرتبط ب C4b (C4BP) كعناصر تحكم إيجابية وسلبية ، على التوالي.

  1. قم بتخفيف كل بروتين من البروتينات البشرية (Vn و FH و C4BP) بشكل منفصل إلى 50 نانومتر في Tris-HCl ، درجة الحموضة 9.0 (المخزن المؤقت للطلاء). قم بتوزيع 100 ميكرولتر من محلول البروتين في كل بئر من صفيحة Polysorp microtiter. أغلق الألواح بالغطاء واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل (16 ساعة) لتسهيل تثبيت البروتين على آبار الألواح الدقيقة
  2. تخلص من المحلول من لوحة الميكروتيتر عن طريق إمالته رأسا على عقب فوق الحوض واغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 300 ميكرولتر من PBS / البئر. سد الآبار المطلية لمدة 1 ساعة في RT باستخدام PBS الذي يحتوي على 2.5٪ (وزن / حجم) BSA (PBS-BSA).
  3. بعد إزالة محلول المنع ، اغسل الآبار ثلاث مرات ب 300 ميكرولتر من PBS تحتوي على 0.05٪ (حجم / حجم) توين 20 (PBST) لكل بئر. أضف 100 ميكرولتر من 50 نانومتر من الرقم الهيدروجيني المؤتلف الموسوم به إلى كل عينة جيدا واحتضانها لمدة ساعة واحدة في RT. في آبار التحكم ، أضف 100 ميكرولتر فقط من PBS-BSA.
    ملاحظه: تم تضخيم جين lph الذي يشفر PH من Hif بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل واستنساخه في متجه التعبير pET26b الذي يضيف علامة 6× له عند الطرف C للبروتين المعبر عنه. تم تحويل المتجه المؤتلف إلى بكتريا قولونية BL21 (DE3) للتعبير. تم استخدام راتنج Ni-NTA لتنقية البروتين المؤتلف.
  4. تخلص من محلول البروتين وقم بإزالة البروتينات غير المرتبطة عن طريق غسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 300 ميكرولتر من PBST لكل بئر. أضف 100 ميكرولتر من PBS-BSA الذي يحتوي على بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) المترافق المضاد ل His pAbs (تخفيف 1: 10،000) واحتضانه لمدة ساعة واحدة في RT.
  5. تحضير محلول 20 ملي مولار أ عن طريق إذابة رباعي ميثيل بنزيدين في محلول 5٪ أسيتون و 45٪ ميثانول. لتحضير المحلول B ، قم بإذابة 19.2 جم من حامض الستريك في 1,000 مل من H2O ، واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 4.25 بإضافة KOH ، ثم أضف 230 ميكرولتر من 30٪ H2O2. قم بتخزين كلا الحلين في الظلام في RT. قبل الاستخدام مباشرة ، امزج 500 ميكرولتر من المحلول B مع 9.5 مل من المحلول A لتحضير كاشف الكشف ELISA.
  6. اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 300 ميكرولتر من PBST لكل بئر واكتشف مجمعات الأجسام المضادة للمستضد عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من كاشف الكشف عن ELISA إلى كل بئر.
  7. أضف 50 ميكرولتر من 1 م H2SO4 / جيدا لإيقاف التفاعل. قم بقياس الكثافة البصرية للآبار عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الألواح الدقيقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments مستشعرات AR2G علوم الحياة بال 18-5095 مستشعر للبروتين الثابت عن طريق الاقتران الأميني أسيتون VWR 97064-786 درجة التحليل ألبومينات مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتش أ 2058 مناسبة لزراعة الخلايا C4BP (بروتين ملزم C4b) تكميلية للتكنولوجيا ، وشركة أ 109 تم شراؤها كشكل سائل مجمد حامض الستريك سيجما ألدريتش 251275-500 جرام درجة الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS) الأجسام المضادة المضادة لعلامة HIRP المترافقة أبكام أب1269 متعدد النسيلة C4BP تكميلية للتكنولوجيا ، وشركة أ 109 محلول مجمد عمود راتنج تقارب الهيستيدين (HisTrap HP) جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة 17-5247-01 أعمدة معبأة مسبقا مع Ni Sepharose له الموسومة PH يتم التعبير عنها وتنقيتها بشكل مؤتلف في مختبرنا ميثانو VWR BDH1135-1 ليرة لبنانية درجة التحليل البلازميد الذي يحتوي على C-terminal 6x His-tag على العمود الفقري (pET26 (b)) نوفاجين 69862-3 ناقل الحمض النووي ألواح الميكروتيتر Polysorb سيجما ألدريتش M9410 ل ELISA رباعي ميثيل بنزيدين سيجما ألدريتش 860336-100 ملغ درجة ELISA فيترونكتين (Vn) من البلازما البشرية سيجما ألدريتش V8379-50UG درجة زراعة الخلية

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

ELISA MethodProtein Protein InteractionBait ProteinPrey ProteinHorseradish PeroxidaseMicroplate ReaderHistidine TagAnti His AntibodyPBS BufferBSA Blocking

Related Articles