مقايسة المستشعر الحيوي الموصلية القائمة على β-اللاكتاماز لتفاعلات البروتين والبروتين

الملخص

المصدر: Vandevenne، M.، et al. استخدام مقايسة الاستشعار الحيوي الموصلية القائمة على β اللاكتاماز للكشف عن التفاعلات الجزيئية الحيوية. J. Vis. إكسب. (2018)

يوضح هذا الفيديو مقايسة مستشعر حيوي موصلية لدراسة تفاعل الجسم المضاد مع مستضد مستهدف ثابت على شريحة محول الطاقة. تم تصميم المستشعر الحيوي ليحتوي على بروتين خيميري ثنائي الوظيفة - إنزيم β لاكتاماز مع موقع تحفيزي وظيفي مدمج في جسم نانوي للارتباط بالمستضد المستهدف الثابت للحركة. عند الارتباط ، يولد التحلل المائي التحفيزي لركيزة المضادات الحيوية بواسطة إنزيم β-lactamase إشارة كهربائية - مما يؤكد تفاعل المستضد والأجسام المضادة.

البروتوكول

فئة

1. تحضير عينة البروتين

1. إنتاج وتنقية البروتين الهجين BlaP-cAb-Lys3 كما ورد في دراستنا السابقة. قم بتخزين البروتين في 50 ملي مولار من الفوسفات الرقم الهيدروجيني 7.4 بالتركيبة التالية: 8 جم من كلوريد الصوديوم ، 0.2 جم من كلوريد الصوديوم ، 1.44 جم من Na₂HPO₄ و 0.24 جم من KH₂PO₄ مذاب في 800 مل من الماء المقطر قم بإصلاح درجة الحموضة في المحلول إلى 7.4 قبل ضبط الحجم النهائي للمحلول إلى 1 لتر. قم بتعقيم محلول البروتين.
2. تحضير محلول مخزون بياض بيض الدجاجة (HEWL). قم بإذابة 100 مجم (40,000 وحدة / مجم) من HEWL المشتراة تجاريا في 10 مل من محلول ملحي للفوسفات (PBS انظر الخطوة 2.1.1). تعقيم محلول البروتين عن طريق الترشيح باستخدام المرشحات بقطع 0.22 ميكرومتر.

< p class = "jove_title" >2. فحوصات المستشعر الحيوي

1. تحضير الحل والمخزن المؤقت
   1. قم بإعداد 50 ملي مولار PBS عن طريق إذابة 8 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.2 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.44 جم من Na₂HPO₄ ، و 0.24 جم من KH₂PO₄ في 800 مل من الماء المقطر. اضبط على درجة الحموضة 7.4 باستخدام 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك أو 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم قبل ضبط حجم المحلول إلى 1 لتر. قم بتعقيمه وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
   2. تحضير محلول التشبع / الانسداد عن طريق إذابة 3 جم من الكازين المتحلل في 100 مل من PBS المحضر كما هو موضح أعلاه (انظر الخطوة 2.1.1). قم بتعقيم الفلتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
   3. قم بإعداد محلول ملزم عن طريق إذابة 1 جم من تحلل الكازين في 100 مل من PBS المحضر كما هو موضح أعلاه (انظر الخطوة 2.1.1). قم بتعقيم الفلتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
   4. قم بإعداد محلول غسيل (0.1٪ توين - PBS) بإضافة 100 ميكرولتر من توين 20 (100٪) في 100 مل من PBS المحضر كما هو موضح أعلاه (انظر الخطوة 2.1.1). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   5. قم بإعداد محلول تحضير قطب كهربائي (1٪ Triton X-100 - PBS) عن طريق إضافة 1 مل من Triton X-100 (100٪) في 100 مل من PBS المحضر كما هو موضح أعلاه (انظر الخطوة 2.1.1). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   6. قم بإعداد محلول تجديد القطب الكهربائي (3.5 M KCl) عن طريق إذابة 26 جم من KCl في الماء المقطر إلى حجم نهائي قدره 100 مل. يتم تعقيم الفلتر وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   7. قم بإعداد محلول كلوريد الصوديوم 5 ملي مولار عن طريق إذابة 0.29 جم من كلوريد الصوديوم في الماء المقطر إلى حجم نهائي قدره 1 لتر. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الكشف (4 ملي مولار بنزيل البنسلين) عن طريق إذابة 26.7 مجم من البنزيل البنسلين في 20 مل من محلول كلوريد الصوديوم 5 مللي. قم بتعقيمها وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
2. إعداد المستشعر وتجديده
   ملاحظه: تم تطوير رقائق الاستشعار المطلية بالبولي أنيلين وتقديمها بلطف من قبل الدكتور ب. بوجارتس ، والدكتور إس يونس ، والبروفيسور واي جلوبزينسكي (الجامعة الكاثوليكية في لوفان لا نوف - تشو مونت جودين). تم تفصيل وصف المستشعر بالإضافة إلى بروتوكولات البلمرة الكهربائية البولي أنيلين المستخدمة لتصنيع هذه المستشعرات في عملهم السابق. باختصار ، يستخدم هذا النظام أجهزة استشعار قابلة لإعادة الاستخدام من ثماني رقائق فردية تم تصنيعها بواسطة تقنيات لوحات الدوائر المطبوعة الكلاسيكية (PCB). تتكون الرقائق الفردية من ثلاث نقاط مستديرة من الأقطاب الكهربائية. الجزء العلوي هو القطب الكهربائي العامل الذي تم تصنيع البولي أنيلين عليه كهربائيا. القطب الأوسط هو القطب المرجعي ويشكل القطب السفلي القطب المضاد. يتم تشغيل كل من الأقطاب المرجعية والمضادة باستخدام ملغم Ag / AgCl الصلب أعلى طبقة الكربون.
   1. قم بإجراء 3 غسلات من الأقطاب الكهربائية عن طريق غمس الأطراف في آبار صفيحة مكونة من 96 بئرا تحتوي على 300 ميكرولتر / بئر من محلول تحضير القطب الكهربائي (1٪ Triton X-100 - PBS ، انظر الخطوة 2.1.5). قم بإجراء كل غسلة لمدة 2 دقيقة مع الخلط اللطيف في درجة حرارة الغرفة.
   2. اشطف الأقطاب الكهربائية عن طريق غمس الأطراف في آبار صفيحة مكونة من 96 بئرا تحتوي على 300 ميكرولتر / بئر من الماء المقطر لمدة دقيقتين مع خلط لطيف في درجة حرارة الغرفة.
   3. قم بتجديد الأقطاب الكهربائية عن طريق غمس الأطراف في آبار صفيحة مكونة من 96 بئرا تحتوي على 300 ميكرولتر / بئر من محلول التجديد (3.5 M KCl ، انظر الخطوة 2.1.6) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية أو 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   4. قم بإجراء 3 غسلات من الأقطاب الكهربائية عن طريق غمس الأطراف في آبار صفيحة مكونة من 96 بئرا تحتوي على 300 ميكرولتر / بئر من محلول ملحي عازل للفوسفات (انظر الخطوة 2.1.1). قم بإجراء كل غسلة لمدة دقيقتين مع الخلط اللطيف في درجة حرارة الغرفة.
3. إجراء فحص الربط على المستشعر
   1. قم بتغطية HEWL على سطح PANI (البولي أنيلين) للقطب الكهربائي عن طريق ترسيب قطرة 15 ميكرولتر من 40 ميكروغرام / مل HEWL المحضرة في PBS على سطح القطب. احتضن طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   2. قم بإجراء ثلاث عمليات غسل للأقطاب الكهربائية باستخدام محلول ملحي عازل للفوسفات (انظر الخطوة 2.1.1) عن طريق غمس أجزاء القطب الكهربائي لرقائق المستشعر في آبار صفيحة 96 بئرا تحتوي على 300 ميكرولتر / بئر من محلول ملحي عازل للفوسفات. قم بإجراء كل غسلة لمدة 2 دقيقة مع الخلط اللطيف في درجة حرارة الغرفة.
   3. قم بتشبع الأقطاب الكهربائية عن طريق إضافة قطرة 50 ميكرولتر من محلول الحظر (انظر الخطوة 2.1.2) على سطح القطب. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل ثلاث مرات كما هو موضح في الخطوة السابقة (انظر الخطوة 2.3.2).
   4. قم بتخفيف محلول BlaP-cAb-Lys3 إلى 20 ميكروغرام / مل في محلول ربط (انظر الخطوة 2.1.3) وقم بتطبيق قطرة 15 ميكرولتر من هذا المحلول المخفف على الأقطاب الكهربائية. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد تفاعل المستضد والجسم النانوي ، اغسل ثلاث مرات كما هو موضح في الخطوة السابقة باستخدام محلول الغسيل (انظر الخطوة 2.1.4). ثم اشطف القطب مرة واحدة باستخدام PBS (انظر الخطوة 2.1.1).
   5. للكشف ، قم بتوصيل شريحة المستشعر عبر جزء الدوائر النحاسية بمقياس رقمي متعدد. بعد ذلك ، ابدأ استجابة المستشعر عن طريق تطبيق قطرة 50 ميكرولتر من محلول الكشف (انظر الخطوة 2.1.7) على الأقطاب الكهربائية الموجبة وتطبيق قطرة 50 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم 5 ملي مولار على الأقطاب الكهربائية السالبة (انظر الخطوة 2.1.7). احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. راقب التوصيل باستخدام مقياس رقمي متعدد.
      ملاحظه: تم توفير المقياس المتعدد من قبل الدكتور P. Bogaerts ، والدكتور S. Yunus ، والبروفيسور Y. Glupczynski (الجامعة الكاثوليكية في Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. يتم التحكم في هذا الجهد بواسطة الكمبيوتر عبر منفذ USB ويحلل الرقائق الثماني المختلفة للمستشعر في وقت واحد. يقوم البرنامج الذي أنشأه يونس وزملاؤه بإنشاء مخطط في الوقت الفعلي يمثل قياسات فرق الموصلية بين الأقطاب المرجعية والعينة مقابل الوقت.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكواشف KH₂PO₄ سيجما ألدريتش V000225 ك₂[هب]₄ سيجما ألدريتش 1551128 كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش إس 7653 تريس - حمض الهيدروكلوريك روش 10812846001 EDTA سيجما ألدريتش E9884 كيه سي إل سيجما ألدريتش ص 9541 نا₂HPO₄ سيجما ألدريتش NIST2186II 2-ميركابتو إيثانول سيجما ألدريتش M6250 ألانين سيجما ألدريتش أ 7627 حمض الهيدروكلوريك₄ فلوكا 34288 حل 1M HClO4 ، الموزع: Sigma-Aldrich الكازين المتحلل سيجما ألدريتش هاتف 22090 بنزيل بنسلين الصوديوم سيجما ألدريتش B0900000 ليزوزيم بياض بيض الدجاجة روش 10837059001 هيبتان سيجما ألدريتش 246654 ميثانول سيجما ألدريتش 322415 محلول هيدروكسيد الأمونيوم سيجما ألدريتش 380539 28٪ NH₃ في H2O ، منقى بالتقطير المزدوج (مركز؟) المواد الاستهلاكية المختبرية 6 آبار لوحة غرينر بيو ون 657165 CELLSTAR 6-Well لوحة معدات مقياس الأس الهيدروجيني WTW 1AA110 مقياس الأس الهيدروجيني في المختبر inoLab pH 7110 نظام الفراغ والترشيح نالجين NALG300-4100 حاملات المرشحات مع جهاز الاستقبال ، الموزع: VWR رقائق مستشعر قياس الجهد صنع بواسطة يونس وزملاؤه (المرجع 16) PGSTAT30 أوتولاب ميتروم أوتولاب توقف ، خليفة Autolab PGSTAT302N مقياس رقمي متعدد ، METRAHit 22M جوسن ميتراوات توقف ، قاعدة ميتراهيت الخلف