مسبار الببتيد المخترق للخلايا الحيوية للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين

الملخص

المصدر: Jaraíz-Rodríguez، M. et al.، الببتيدات المخترقة للخلايا البيوتينيلية لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين داخل الخلايا. J. Vis. إكسب. (2017).

يوضح هذا الفيديو تقنية تستخدم الببتيدات المخترقة للخلايا الحيوية للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين داخل الخلايا. تسهل الببتيدات المخترقة للخلية دخول الببتيد المترافق إلى الخلية والارتباط على وجه التحديد ببروتيناتها المتفاعلة. يسمح البيوتين ، بعد الارتباط بأفيدين ، بتنقية مركب البروتينات المتفاعلة من محللة الخلية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الخلايا

1. قبل يومين من بدء الإجراء ، قم بلوحة الخلايا بالكثافة المطلوبة لتكون ملتقية في يوم التجربة. ضع الخلايا في قوارير أو أطباق. ومع ذلك ، سيكون استخراج البروتين أسهل من اللوحات. من الملائم تحضير ما لا يقل عن 4 أطباق بحجم 78 سم² أو 2 قارورة بحجم 150 سم² لكل حالة لكل تجربة ، للتأكد من اتساق النتائج.
2. في هذه الدراسة ، صفيحة G166 GSCs البشرية في 4 قوارير بحجم 150 سم² ، مستزرعة في وسط الخلايا الجذعية RHB-A المكملة ب 2٪ B27 ، و 1٪ N2 ، و 20 نانوغرام / مل EGF ، و b-FGF كما وصفها بولارد وآخرون. العملية عند الوصول إلى التقاء. على سبيل المثال ، عندما تم طلاء خلايا 5 × 10⁶ G166 في قارورة 150 سم

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خط G166 GSC بيوريب RHB-A الخلايا الجذعية المتوسطة تاكارا Y40001 بروتين الفأر اللامينين Invitrogen ، تقنيات الحياة ، ThermoFisher Scientific 23017-015 10 ميكروغرام / مل مكمل غذائي خال من المصل B-27 (50X) Invitrogen ، تقنيات الحياة ، ThermoFisher Scientific 17504-044 2٪ ملحق N-2 (100x) Invitrogen ، تقنيات الحياة ، ThermoFisher Scientific 17502-048 1٪ EGF البشري المؤتلف بيبروتك AF-100-15 20 نانوغرام / مل المؤتلف البشري b-FGF بيبروتك AF-100-18B 20 نانوغرام / مل PBS الرقم الهيدروجيني 7.4: في الماء منزوع الأيونات ، 136 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 2.7 ملي كلوريد كلوريد الصوديوم ؛ 7.8 ملي Na2HPO4 · 2H2O ؛ 1.7 ملي مولار KH2PO4 تات GenScript حسب الطلب TAT-B GenScript حسب الطلب TAT-CX43266-283 GenScript حسب الطلب TAT-CX43266-283-ب GenScript حسب الطلب بيرس™ نيوترأفيدين™ أغاروز ثيرموفيشر العلمي 29200 مخزن تحلل البروتين: 5 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6.8) ، 2٪ (وزن / حجم) SDS ، 2 ملي مولار EDTA ، 2 ملي مولار EGTA فلوريد الصوديوم PanReac AppliChem 141675 1 ملي متر فلوريد فينيل ميثان سولفونيل (PMSF) سيجما ألدريتش ص 7626 1 ملي متر أورثوفانادات الصوديوم سيجما ألدريتش S6508 0.1 ملي عازلة Laemmli: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8 ؛ 5 M glycerol ؛ 3.7٪ (w / v) SDS ؛ 0.6 M β-mercaptoethanol أو 9 mM DTT ؛ 0.04٪ (v / v) bromophenol blue (BB).