مسبار الببتيد المخترق للخلايا الحيوية للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين

الملخص

المصدر: Jaraíz-Rodríguez، M. et al.، الببتيدات المخترقة للخلايا البيوتينيلية لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين داخل الخلايا. J. Vis. إكسب. (2017).

يوضح هذا الفيديو تقنية تستخدم الببتيدات المخترقة للخلايا الحيوية للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين داخل الخلايا. تسهل الببتيدات المخترقة للخلية دخول الببتيد المترافق إلى الخلية والارتباط على وجه التحديد ببروتيناتها المتفاعلة. يسمح البيوتين ، بعد الارتباط بأفيدين ، بتنقية مركب البروتينات المتفاعلة من محللة الخلية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الخلايا

1. قبل يومين من بدء الإجراء ، قم بلوحة الخلايا بالكثافة المطلوبة لتكون ملتقية في يوم التجربة. ضع الخلايا في قوارير أو أطباق. ومع ذلك ، سيكون استخراج البروتين أسهل من اللوحات. من الملائم تحضير ما لا يقل عن 4 أطباق بحجم 78 سم² أو 2 قارورة بحجم 150 سم² لكل حالة لكل تجربة ، للتأكد من اتساق النتائج.
2. في هذه الدراسة ، صفيحة G166 GSCs البشرية في 4 قوارير بحجم 150 سم² ، مستزرعة في وسط الخلايا الجذعية RHB-A المكملة ب 2٪ B27 ، و 1٪ N2 ، و 20 نانوغرام / مل EGF ، و b-FGF كما وصفها بولارد وآخرون. العملية عند الوصول إلى التقاء. على سبيل المثال ، عندما تم طلاء خلايا 5 × 10⁶ G166 في قارورة 150 سم² ، تمت معالجتها بعد يومين من الطلاء.

< p class = "jove_title" >2. CPPs البيوتينيل

1. قم بتدوير القوارير التي تحتوي على CPPs المجففة بالتجميد (BCPPs) عند 8200 × جم لمدة 30 ثانية ، لتجنب بقاء بعض المسحوق على الغطاء. قم بتضمين BCPP عنصر تحكم للتأكد من أن التفاعلات التي تم العثور عليها خاصة بالتسلسل الهدف. في هذه الدراسة ، كان التحكم BCPP هو TATbiotin (TAT-B) ، وكان العلاج BCPP هو TAT-Cx43_266-283-B. يمكن استخدام ضوابط أخرى ، مثل TAT المدمجة في الشظايا المخلوطة أو المتحولة المرتبطة بالبيوتين.
2. قم بإذابة BCPPs في وسط الاستزراع المقابل لمحلول المخزون المشار إليه من قبل الشركة المصنعة ؛ على سبيل المثال ، للحصول على محلول مخزون 2 مجم / مل BCPP لمعالجة GSCs ، أضف 0.5 مل من وسط استزراع GSC إلى قارورة واحدة تحتوي على 1 مجم من BCPP. دوامة وتأكد من إذابة الببتيد جيدا.

< ص الفئة = "jove_title" >3. الأنابيب

ملاحظة: قم بإعداد ما لا يقل عن اثني عشر أنبوبا سعة 1.5 مل لكل شرط مطلوب في القسم

1. ضع علامة على أول 3 أنابيب لكل حالة. سيكون لديهم الحجم الإجمالي للمحللات الخلوية التي تم الحصول عليها في الخطوة 6.4.
2. ضع علامة A في 3 أنابيب لكل حالة. ستحتوي هذه الأنابيب على أول المواد الطفية التي تم الحصول عليها بعد تحلل وتدوير المحللات الخلوية ، الخطوة 7.2.
3. ضع علامة B في 3 أنابيب لكل حالة. سيكون لهذه الأنابيب حصة صغيرة من المواد الطاففية الأولى. ستكون هذه المحللات بمثابة عينات اللطخة الغربية في الخطوة 7.3.
4. ضع علامة C في 3 أنابيب لكل حالة. ستحتوي هذه الأنابيب على المواد الطافية التي تم الحصول عليها بعد السحب باستخدام NeutrAvidin، الخطوة 7.7.
   ملاحظه: هذا مهم في حالة عدم ظهور اللطخة الغربية أي إشارة للبروتينات ، مما يعني أن البروتينات لم يتم سحبها أو فقدت في مرحلة ما من الإجراء. إذا كان هذا هو الموقف ، كرر العملية لسحب البروتينات.

< p class = "jove_title" >4. العلاج الخلوي باستخدام BCPPs

1. استنشق وسط الثقافة.
2. استبدل الحجم المقابل من الوسط الطازج المطلوب لاحتضان BCPPs في أصغر حجم ممكن من الوسط وفقا لأوقات الحضانة. من المهم جدا أن يغطي الوسيط على أي حال كامل سطح اللوحة / القارورة بالكامل حتى لا تجف الخلايا ، على سبيل المثال ، 6 مل لكل 150 سم² لمدة 30 دقيقة.
3. أضف حجم محلول مخزون BCPP إلى مزارع الخلايا للوصول إلى التركيز الذي ثبت فعاليته. في هذه الدراسة ، ثبت أن 50 ميكرومتر TAT-Cx43266-283-B يقلل من انتشار GSC.
   1. لذلك ، أضف 92.8 ميكرولتر من 2 مجم / مل TAT-Cx43_266-283-B (MW = 3723.34 جم / مول) لكل مل من وسط الاستزراع للحصول على تركيز نهائي قدره 50 ميكرومتر TAT-Cx43_266-283-B. إذا كان الحجم المراد إضافته مختلفا بالنسبة لببتيدات التحكم، فاستكمل بوسيط الثقافة حتى نفس الحجم النهائي. على سبيل المثال ، تمت إضافة 49.1 ميكرولتر TAT-B (MW = 1914.31 جم / مول) بالإضافة إلى 43.7 ميكرولتر من وسط GSC لكل مل من وسط الاستزراع للحصول على تركيز نهائي قدره 50 ميكرومتر من TAT-B.
4. ضع الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 30 دقيقة للتأكد من حدوث التفاعلات بين BCPP وشركائها داخل الخلايا. إذا استغرق التفاعل وقتا أطول ، فقم باحتضانه لأوقات أطول أو اضبط الأوقات في حالة تتكون التجربة من دورة زمنية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعزيز تفاعل الاهتمام أو منعه عن طريق تحفيز مسارات الإشارات المختلفة داخل الخلايا.

5. المخازن المؤقتة والحلول

1. تحضير PBS درجة الحموضة 7.4: 136 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 2.7 ملي كلوريد كلوريد ؛ 7.8 ملي أمبير_{Na 2}HPO₄ · 2 ساعة₂O ؛ 1.7 ملي هيلو هيلومتري₂PO₄.
2. تحضير المخزن المؤقت لتحلل البروتين: 20 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) ، 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 1٪ IGIGAL ، قبل الاستخدام ، أضف ما يلي: 1/100 (حجم / حجم) كوكتيل مثبط للبروتياز ، 1 ملي فلوريد الصوديوم ، 1 ملي فلوريد فينيل ميثان سولفونيل (PMSF) و 0.1 ملي من أورثوفانادات الصوديوم.
3. تحضير عازلة Laemmli: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8 ؛ 5 M glycerol ؛ 3.7٪ SDS (p / v) ؛ 0.6 M β-mercaptoethanol أو 9 mM DTT ؛ 0.04٪ (حجم / حجم) بروموفينول أزرق (BB)).

< ص class = "jove_title" >6. استخراج البروتين

ملاحظة: تم إجراء استخراج البروتين كما هو موضح سابقا. قم بتنفيذ هذا القسم بأكمله من الإجراء عند 4 درجات مئوية.

1. استنشق وسط الثقافة تماما.
2. اغسل 3 × 10 مل بمحلول ملحي مخزاز بالفوسفات المثلج (PBS) لكل 150 سم² بعناية فائقة لتجنب انفصال الخلايا.
3. للحصول على محللة الخلية ، أضف 3 مل من محلول التحلل لكل 150 سم² وكشط السطح جيدا باستخدام مكشطة الخلية. سيؤدي إمالة اللوحة / القارورة إلى حوالي 45 درجة إلى تسهيل تجميع محللات الخلية في الأنابيب المقابلة لها.
4. صب 1 مل من المحللة الخلوية لكل أنبوب في ثلاثة أنابيب سعة 1.5 مل. سيتم تمييز هذه الأنابيب بالحالة والتكرار كما هو موضح في الخطوة 3.1.

7. منسدل

1. جهاز الطرد المركزي لأنابيب 1.5 مل عند 11,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
2. نقل المواد الطفية إلى أنابيب جديدة (أ).
3. خذ حصة من هذا المادة الطافية لكل حالة إلى أنابيب مختلفة (B) ، أي 50 ميكرولتر لكل أنبوب. أضف 4x عازلة Laemmli (16.6 ميكرولتر لكل 50 ميكرولتر من المحلل) وقم بتجميدها عند -20 درجة مئوية. ستكون هذه المحللات بمثابة عينات لطخة غربية معتادة.
4. تجانس جيد جدا NeutrAvidin Agarose عن طريق الاهتزاز اللطيف. قم بقص أطراف أطراف الماصة لزيادة قطرها وتحسين سحب الخرز. أضف 50 ميكرولتر من NeutrAvidin Agarose لكل مل من محللات الخلية في الأنابيب (A).
5. احتضان عند 4 درجات مئوية طوال الليل مع اهتزاز لطيف جدا للسماح ل NeutrAvidin بالتفاعل مع BCPPs المرتبطة بشركائها داخل الخلايا.
6. جهاز طرد مركزي عند 3,000 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية لجمع مركب NeutrAvidin مع البروتينات.
7. قم بإزالة المواد الطافية بعناية ونقلها إلى أنابيب نظيفة (C). احتفظ بها لاستخدامها في حالة عدم نجاح المنسدل.
8. خطوات الغسيل: أضف عازلة تحلل جديدة إلى الكريات (الأنابيب أ) ، وأعد التعليق عن طريق الانعكاس ، وكرر الخطوتين 7.6 و 7.7 خمس مرات أخرى. يمكن التخلص من كل هذه المواد الطافية.
9. قم بإزالة المواد الطافية وأضف 2x عازلة Laemmli إلى الحجم النهائي المطلوب (40 ميكرولتر لكل أنبوب 1.5 مل للكريات التي تم الحصول عليها من قوارير سم² من الخلايا المتقاربة).
10. قم بفصل التفاعلات بين البروتينات وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 8,200 × جم إلى حبيبات حبيبات NeutrAvidin.
11. خذ المواد الطافية ، التي تحتوي على البروتينات المنفصلة ، مع أطراف شعرية إلى أنابيب جديدة (D). يمكن الاحتفاظ بالخرزات في حالة الحاجة إلى تكرار خطوات الشطف.
    ملاحظه: المواد الطافية (الأنابيب D) جاهزة الآن للتحميل في لطخة غربية أو للتجميد عند -20 درجة مئوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خط G166 GSC بيوريب RHB-A الخلايا الجذعية المتوسطة تاكارا Y40001 بروتين الفأر اللامينين Invitrogen ، تقنيات الحياة ، ThermoFisher Scientific 23017-015 10 ميكروغرام / مل مكمل غذائي خال من المصل B-27 (50X) Invitrogen ، تقنيات الحياة ، ThermoFisher Scientific 17504-044 2٪ ملحق N-2 (100x) Invitrogen ، تقنيات الحياة ، ThermoFisher Scientific 17502-048 1٪ EGF البشري المؤتلف بيبروتك AF-100-15 20 نانوغرام / مل المؤتلف البشري b-FGF بيبروتك AF-100-18B 20 نانوغرام / مل PBS الرقم الهيدروجيني 7.4: في الماء منزوع الأيونات ، 136 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 2.7 ملي كلوريد كلوريد الصوديوم ؛ 7.8 ملي Na2HPO4 · 2H2O ؛ 1.7 ملي مولار KH2PO4 تات GenScript حسب الطلب TAT-B GenScript حسب الطلب TAT-CX43266-283 GenScript حسب الطلب TAT-CX43266-283-ب GenScript حسب الطلب بيرس™ نيوترأفيدين™ أغاروز ثيرموفيشر العلمي 29200 مخزن تحلل البروتين: 5 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6.8) ، 2٪ (وزن / حجم) SDS ، 2 ملي مولار EDTA ، 2 ملي مولار EGTA فلوريد الصوديوم PanReac AppliChem 141675 1 ملي متر فلوريد فينيل ميثان سولفونيل (PMSF) سيجما ألدريتش ص 7626 1 ملي متر أورثوفانادات الصوديوم سيجما ألدريتش S6508 0.1 ملي عازلة Laemmli: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8 ؛ 5 M glycerol ؛ 3.7٪ (w / v) SDS ؛ 0.6 M β-mercaptoethanol أو 9 mM DTT ؛ 0.04٪ (v / v) bromophenol blue (BB).