مقايسة الخميرة ثنائية الهجين لتحديد الارتباط الذاتي للبروتين في خلايا الخميرة

الملخص

المصدر: Stanczyk ، P. J. ، et al. ، الأساليب الجينية والكيميائية الحيوية لتقييم قلة البروتين في الجسم الحي وفي المختبر: دراسة حالة مستقبلات الريانودين. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو اختبار الخميرة الهجينة للكشف عن تفاعلات ذاتية معينة للبروتين. في هذا الاختبار ، يتم تمييز البروتين محل الاهتمام بمجالين من عامل النسخ الذي يشفر إنزيم β-galactosidase. عندما يتفاعل البروتينان ، يؤدي ذلك إلى تكوين الإنزيم والنسخ والترجمة ، والذي يتم اكتشافه بعد ذلك باستخدام مقايسة كيميائية حيوية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحول الخميرة

1. حصاد الخميرة عن طريق الطرد المركزي (في أنابيب 50 مل) عند 1,500 × جم لمدة 5 دقائق في RT. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق كل حبيبات في 5 مل من H₂O المعقم ، واجمعها معا.
2. أعد جهاز الطرد المركزي عند 1,500 × جم لمدة 5 دقائق في RT وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخميرة في 1 مل من الطازجة والمعقمة 1x LiAc / TE.
   ملاحظه: استخدم خلايا الخميرة المختصة في غضون 1 ساعة من التحضير.
3. قم بإعداد عينات البلازميد (في أنابيب سعة 1.5 مل) عن طريق إضافة 200 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد للتحولات الفردية ، أو 0.5 - 1 ميكروغرام من كل حمض نووي بلازميد للتحولات المشتركة ، و 100 ميكروغرام من الحمض النووي الحامل لخصيتي الرنجة (مغلي لمدة 20 دقيقة ويبرد على الجليد قبل الاستخدام مباشرة).
   ملاحظة: قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي ، على سبيل المثال ، الخميرة التي تم تحويلها بشكل مشترك مع pVA3 (ترميز اندماج GAL4 DNA-BD مع بروتين p53) و pTD1 (ترميز اندماج GAL4 AD مع مستضد SV40 T الكبير).
4. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخميرة الطازج والمختص و 600 ميكرولتر من محلول 1x LiAc / PEG (8 مل من المخزون PEG 3350 ، 1 مل من المخزون TE ، 1 مل من LiAc) ، والدوامة لمدة ~ 30 ثانية. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
5. أضف 80 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (10٪ من التركيز النهائي للحجم / الحجم) واخلطه جيدا عن طريق الانعكاس اللطيف. صدمة حرارية لمدة 15 دقيقة في حمام مائي 42 درجة مئوية أثناء الخلط كل 2-3 دقائق.
قم
6. بتعليق خلية التبريد على الجليد لمدة دقيقتين وجهاز الطرد المركزي عند 14,000 × جم لمدة 15 ثانية في RT لاستعادة الخميرة.
7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من 1x TE ولوحة على صفائح متوسطة SD مناسبة للنمو الانتقائي (وسط يفتقر إلى الليوسين والتربتوفان للحفاظ على الضغط الانتقائي على كل من الطعم والبلازميدات المستهدفة).
8. احتضان الصفائح رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية حتى يصل قطر المستعمرات إلى ~ 2 مم (عادة من 4 إلى 5 أيام). يمكن تخزين الألواح عند 4 درجات مئوية لمدة 2-3 أسابيع ؛ لتخزين أطول ، قم بعمل مخزون الجلسرين وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية
   ملاحظه: تحقق من أن الطعم والبروتينات المستهدفة يتم التعبير عنها في الخميرة عن طريق النشاف المناعي وأنه ليس لديهم تنشيط جيني مستقل للمراسل عند التعبير عنها بشكل منفصل في الخميرة.
9. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخميرة الطازج والمختص و 600 ميكرولتر من محلول 1x LiAc / PEG (8 مل من المخزون PEG 3350 ، 1 مل من المخزون TE ، 1 مل من LiAc) ، والدوامة لمدة ~ 30 ثانية. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
10. أضف 80 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (10٪ من التركيز النهائي للحجم / الحجم) واخلطه جيدا عن طريق الانعكاس اللطيف. صدمة حرارية لمدة 15 دقيقة في حمام مائي 42 درجة مئوية أثناء الخلط كل 2-3 دقائق.
قم
11. بتعليق خلية التبريد على الجليد لمدة دقيقتين وجهاز الطرد المركزي عند 14,000 × جم لمدة 15 ثانية في RT لاستعادة الخميرة.
12. أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من 1x TE ولوحة على صفائح متوسطة SD مناسبة للنمو الانتقائي (وسط يفتقر إلى الليوسين والتربتوفان للحفاظ على الضغط الانتقائي على كل من الطعم والبلازميدات المستهدفة).
13. احتضان الصفائح رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية حتى يصل قطر المستعمرات إلى ~ 2 مم (عادة من 4 إلى 5 أيام). يمكن تخزين الألواح عند 4 درجات مئوية لمدة 2-3 أسابيع ؛ لتخزين أطول ، قم بعمل مخزون الجلسرين وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية
    ملاحظة: تحقق من أن الطعم والبروتينات المستهدفة يتم التعبير عنها في الخميرة عن طريق النشاف المناعي وأنه ليس لديهم تنشيط جيني مراسل مستقل عند التعبير عنها بشكل منفصل في الخميرة.

< p class = "jove_title" >2. ورقة ترشيح المستعمرة رفع β-Gal Assay

1. قم بإعداد المخازن المؤقتة التالية:
   1. قم بإعداد عازلة Z تحتوي على 100 ملي مولار Na₂HPO₄ و 40 ملي مولار NaH₂PO₄ و 10 ملي مولار KCl و 1 ملي مولار MgSO₄ ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. تعقيم عن طريق التعقيم وتخزينها في RT.
   2. قم بإعداد المخزن المؤقت X-Gal عن طريق إذابة 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside عند 20 مجم / مل في N ، N-dimethylformamide ، وتخزينه في الظلام عند -20 درجة مئوية. قم بإعداد محلول Z buffer / X-Gal. قم بعمل مخزن مؤقت قبل الاستخدام عن طريق خلط X-Gal عند 0.33 مجم / مل و β-mercaptoethanol عند 0.27٪ من الحجم/حجم في Z-buffer. استخدم 2.5 مل لكل عينة.
2. أضف 2.5 مل من محلول Z المؤقت / X-Gal المحضر حديثا إلى لوح نظيف مقاس 100 مم وضعه داخل ورق ترشيح السليلوز.
3. ضع ورقة ترشيح جديدة على سطح اللوحة مع محاوصة مستعمرات الخميرة. افركي ورق الترشيح برفق على اللوحة بالملقط واتركيه لمدة ~ 5 دقائق حتى يتم إرفاق المستعمرات.
   ملاحظه: قم بمعالجة التحكم الإيجابي بالتوازي ، أي الخميرة التي تم تحويلها بشكل مشترك مع pVA3 و pTD1.
4. ارفع ورق الترشيح واغمره (بالملقط) في حوض من النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية (يجب التعامل مع النيتروجين السائل بعناية ؛ ارتد دائما قفازات ونظارات واقية سميكة). دع ورق الترشيح المجمد يذوب عند RT لمدة ~ 2 دقيقة.
5. ضع ورق الترشيح (جانب المستعمرة لأعلى) أعلى ورق الترشيح المنقوع مسبقا داخل اللوحة مقاس 100 مم ، واحتضانه عند 30 درجة مئوية.
6. تحقق بشكل دوري (كل ~ 30 دقيقة) لظهور المستعمرات الزرقاء.
   ملاحظه: الطعم الضعيف: قد تستغرق التفاعلات المستهدفة عدة ساعات لإنتاج إشارة زرقاء إيجابية (تجنب الحضانة المطولة (>8 ساعات) التي قد تعطي نتائج إيجابية خاطئة). للحصول على أفضل النتائج ، استخدم مستعمرات محولة حديثا ، أي تزرع عند 30 درجة مئوية لمدة 4-5 أيام ، بقطر ~ 2 مم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حاضنة الألواح هيروس ب 6120 جهاز حاضنة شاكر مدارية نيو برونزويك العلمي إنوفا 4300 جهاز مقياس الطيف الضوئي بيركين إلمر لامدا بيو + جهاز مجموعة نظام Matchmaker Two-Hybrid 2 تاكارا كلونتك ك 1604-1 يحتوي على ناقلات الطعم pGBKT7 وناقلة الفريسة pACT2 وسلالة الخميرة Y190 قاعدة الخميرة النيتروجينية سيجما ألدريتش Y0626 لتحضير الحد الأدنى من SD تنمو المتوسطة مكمل التسرب الذي يفتقر إلى الليوسين والتربتوفان سيجما ألدريتش Y0750 لتحضير الحد الأدنى من SD تنمو المتوسطة مكمل التسرب الذي يفتقر إلى الليوسين والتربتوفان والهيستيدين سيجما ألدريتش Y2001 لتحضير الحد الأدنى من SD تنمو المتوسطة خصيتين الرنجة الحمض النووي الناقل تاكارا كلونتك 630440 لتحويل الخميرة ورق ترشيح Whatman الصف 5 سيجما ألدريتش WHA1005070 للاستخدام في ورق ترشيح المستعمرة β-Gal إكس غال (5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-β-د-جالاكتوبيرانوسيد) سيجما ألدريتش ب 4252 للاستخدام في ورق ترشيح المستعمرة β-Gal