مقايسة تنقية التقارب الترادفي لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين

الملخص

المصدر: Ma, Z., et al. تنقية التقارب الترادفي لمجمعات البروتين من الخلايا حقيقية النواة. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو تنقية التقارب الترادفي - وهي تقنية لتنقية مجمعات البروتين من الخلايا حقيقية النواة لدراسة تفاعل البروتين والبروتين. يحتوي المركب على بروتينين مصنفين بعلامات حاتمة مختلفة. عند تنقية المركب باستخدام راتنجين مع تقارب مع علامتين مختلفتين بطريقة متسلسلة ، فإن وجود كلا البروتينين في الغطاء يؤكد التفاعل بين الاثنين.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. خلايا الطلاء

1. قبل يوم واحد من التعدي ، لوحة 3.5 × 10⁶ خلايا HEK293T في 10 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مكملة بنسبة 10٪ (v / v) مصل بقري الجنين (FBS) و 1٪ (v / v) البنسلين / الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل) لكل طبق 100 مم. الطبق 3 - 5 100 مم² أطباق لكل تجربة / حالة لضمان استعادة البروتين بشكل كاف><. ملاحظه: يجب تحديد عدد اللوحات لكل تجربة / حالة ، والتي ستعتمد على مستويات التعبير وقابلية ذوبان مركب البروتين المعني. بدلا من ذلك ، إذا كانت هناك حاجة إلى تنقية على نطاق أوسع ، فيمكن تكييف خطوط الخلايا لتنمو في المعلقات في قوارير دوارة ، لكن هذه الطريقة لن تعمل مع عمليات النقل العابرة.

< p class = "jove_title" >2. نقل الخلايا أو إحداث خطوط خلوية مستقرة

1. في اليوم التالي ، افحص الخلايا تحت المجهر. يجب أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 70-80٪ قبل المتابعة.
2. قم بنقل الخلايا بمزيج إجمالي من 7 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد و 21 ميكرولتر من كاشف التعدي لكل طبق 100 مم. الخلايا الشفافة بناقل يعبر عن GFP (الجدول 1) كعنصر تحكم في كفاءة التعدي.
   ملاحظه: في حالة استخدام HEK293-T-REx أو خط خلية مستقر مماثل يحفز التعبير عن وحدتين فرعيتين أو أكثر تعقيدا استجابة للدوكسيسيكلين ، فسيتعين إضافة المحفز إلى الخلايا واحتضانه لمدة 48 ساعة. وبالمثل ، فإن خط الخلية المستقر الذي يحفز التعبير عن GFP عند إضافة المحفز سيكون مطلوبا أيضا لأغراض التحقق من الصحة. انتقل إلى الخطوة 2.7.
3. تحضير خليط التعداء لكل طبق 100 مم. في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، امزج 500 ميكرولتر من DMEM غير المكمل مع 7 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي البلازميد (المقابل اثنين أو أكثر من البلازميدات). في أنبوب منفصل للطرد المركزي المجهري ، امزج 500 ميكرولتر من DMEM غير المكمل مع 21 ميكرولتر من كاشف التعداد. كرر مع كل تفاعل تعدين.
4. ماصة محلول كاشف الإرسال في محلول الحمض النووي البلازميد (لا تخلط المحاليل بترتيب عكسي). تخلط عن طريق سحب العينات 4 مرات على الأقل.
5. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة ، ولكن ليس أكثر من 15 دقيقة.
6. قم بإمالة اللوحة لإنشاء خزان وسائط وقم بسحب خليط التعدي بعناية على الجانب الداخلي من اللوحة دون إزعاج الخلايا. أعد الطبق إلى موضعه الأصلي المسطح ولفه برفق لتوزيع الخليط.
7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ (يشار إلى هذه الحالة فيما يلي باسم "حاضنة زراعة الأنسجة"). استبدل الوسائط بعد 5 ساعات من التعداء (اختياري).

< p class = "jove_title" >3. التحقق من كفاءة التعداء أو الحث

1. في 24 ساعة بعد التعدي ، تصور الخلايا تحت المجهر الفلوري للتحقق من كفاءة التعداء (أو تحريض خط الخلية المستقر HEK293T-REx للتحكم عن GFP). احتضن لمدة 24 ساعة أخرى.

4. تنقية تقارب STREP (STREP AP)

1. جمع الخلايا
   1. بعد 48 ساعة من التعداء ، قم بإزالة الوسائط وأضف 8 مل من محلول ملحي بارد 1x مخزن بالفوسفات (PBS). الماصة لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا عن اللوحة.
   2. اجمع ونقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل وقم بتدوير الخلايا لأسفل عند 800 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   3. قم بإزالة المادة الطافية PBS. كرر الدوران لأسفل (800 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية) للتخلص من أي PBS متبقي. قم بتخزين حبيبات الخلية عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل أو اتبع الإجراء أدناه لمواصلة تنقية البروتين.
2. لذل الخلايا
   1. أعد تعليق كريات الخلية باستخدام 5× حجم حبيبات الخلية (~ 250 ميكرولتر لكل لوحة) من محلول التحلل السلبي (PLB: 20 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.5 ملي مولار MgCl₂ ، 1 ملي مولار DTT ، قرص كوكتيل مثبط للبروتياز ، 5٪ حجم / حجم الجلسرين ، و 1.0٪ NP-40) ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
   قم
   2. بدوامة التعليق لفترة وجيزة وقم بتسخينه لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   3. قم بتدوير معلق الخلية عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   4. انقل المحللات القابلة للذوبان إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل وتخلص من كريات الخلية. حفظ 10٪ من الحجم النهائي للمحللة القابلة للذوبان ك "STREP AP Input". يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
3. موازنة حبات STREP
   ملاحظه: استخدم حبات STREP لخطوة AP الأولى! تستعيد المجمعات التي تم سحبها بخرز STREP بروتين أكثر بكثير من تلك التي تم سحبها بخرز FLAG.
   1. أخرج (ن × 40 ميكرولتر) + ن ميكرولتر من ملاط حبة STREP بنسبة 50٪ (ن = عدد العينات) وقم بالدوران عند 1,500 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية><. ملاحظة: استخدم أطراف واسعة الفوهة لخرزات الماصة.
   2. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 500 ميكرولتر من PLB إلى الخرز. قم بتقطيع خليط الخرز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، قم بالدوران لأسفل عند 1,500 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
      1. كرر لمدة 3 غسلات. أعد تعليق الخرزات في PLB إلى حجم نهائي من n × 40 ميكرولتر.
   3. أضف 40 ميكرولتر من ملاط حبة STREP بنسبة 50٪ إلى كل عينة محللة خلية وقم بتسخينها لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.
4. STREP AP
   1. قم بتدوير المحلول عند 1,500 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
   2. قم بإزالة المادة الطافية وتخزينها ك "STREP AP Flow-through (FT)" عند 4 درجات مئوية.
   3. أضف 500 ميكرولتر من STREP AP Wash Buffer I (20 ملي مولار Tris-HCl درجة الحموضة 7.5 ، 250 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.5 ملي ملي كلوريد₂ ، 1 ملي مولار DTT ، 5٪ جلسرين ، و 0.2٪ NP-40) إلى الخرز. قم بتقطيع خليط الخرز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وجهاز الطرد المركزي عند 1,500 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
      1. كرر لمدة 4 غسلات.
         ملاحظه: قبل الغسيل الرابع ، انقل محلول الخرز إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل لتقليل خلفية البروتين. هذه الخطوة ضرورية.
   4. أضف 500 ميكرولتر من Wash Buffer II (100 ملي مولار Tris-HCl pH 8.0 و 150 ملي كلوريد الصوديوم و 1 ملي مولار EDTA) وقم بموازنة الخرزات عن طريق عكس الأنابيب. قم بالدوران عند 1,500 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
   5. قم بإزالة البروتين محل الاهتمام باستخدام 50 ميكرولتر من STREP Elution Buffer (100 ملي مولار Tris-HCl درجة الحموضة 8.0 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ، و 2.5 ملي ديستيوبيوتين). دوامة عند 800 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   6. قم بتدوير الخرزات عند 1,500 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. يتوافق هذا الكسر مع عينة "STREP AP Elution".
   7. احتفظ بجزء الخرز عند 4 درجات مئوية لشطف ثان ، والذي يمكن أن ينتج عنه ما يصل إلى نصف كمية البروتين التي تم الحصول عليها مع الشطف الأول. Aliquot 10٪ من STREP AP Elution لتلوين الفضة و / أو النشاف الغربي.
5. موازنة حبات FLAG
   1. أخرج (ن × 16 ميكرولتر) + ن ميكرولتر من محلول خرز FLAG (ن = عدد العينات) وقم بالدوران عند 1,500 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية < / > ملاحظه: استخدم أطراف واسعة الفم لخرزات الماصة.
   2. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل FLAG (100 ملي مولار Tris-HCl pH 8.0 و 150 ملي كلوريد الصوديوم و 1 ملي مولار EDTA و 0.1٪ NP-40) إلى الخرز. قم بالدوران عند 1,500 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. كرر ذلك لمدة 3 غسلات.
   3. أعد تعليق الخرزات في المخزن المؤقت للغسيل FLAG إلى حجم نهائي يبلغ n × 16 ميكرولتر.
   4. أضف 16 ميكرولتر من ملاط حبة FLAG إلى شطف STREP AP المتبقي واتركه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

5. الإبلاغ عن IP

1. قم بتدوير تعليق حبات FLAG عند 1,500 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. احفظ المادة الطافية وقم بتخزينها ك "FLAG IP Flow-through" (FT) عند 4 درجات مئوية.
2. أضف 500 ميكرولتر من مخزن غسيل FLAG إلى المحلول. قم بتسخين الماء لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وجهاز الطرد المركزي عند 1,500 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. كرر لمدة 4 غسلات وقم بإزالة المادة الطافية بعد كل غسلة.
   ملاحظه: قبل الغسيل الرابع ، انقل محلول حبة البروتين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل لتقليل الخلفية. هذه الخطوة ضرورية.
3. قم بإزالة المادة الطافية من الدوران النهائي وأضف 30 ميكرولتر من مخزن غسيل FLAG يحتوي على 200 نانوغرام / ميكرولتر من ببتيد FLAG في الخرز. دوامة عند 800 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.
4. قم بتدوير التعليق عند 1,500 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. احصد المادة الطافية وخزنها عند 4 درجات مئوية ك "FLAG IP Elution".
   ملاحظه: يمكن تأكيد عينات الشطف عن طريق صبغة الفضة و / أو اللطخة الغربية باستخدام البروتوكولات القياسية ، وهي جاهزة لمزيد من فحوصات البروتين. عند إعداد لطخة غربية، قم بتشغيل جميع العينات التالية: (1) إدخال STREP AP ، (2) STREP AP FT ، (3) STREP AP Elution ، (4) FLAG IP FT ، و (5) FLAG IP Elution. يجب تحديد الأحجام التي تم تحميلها لكل تجربة. يمكن تخزين جميع العينات والخرز التي تم جمعها عند 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل وعند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. يمكن تحليل عينات TAP عن طريق قياس الطيف الكتلي للتحقق من هوية مكوناتها ، وتحديد التعديلات الجديدة بعد الترجمة (PTMs) ، و / أو لاكتشاف أي تفاعل بروتين جديد مع المركب المنقى. لهذا الغرض ، بعد تشغيل جل coomassie أو صبغة فضية ، يمكن استئصال الأربطة من الجل باستخدام مشرط نظيف. تم نشر العديد من المراجعات الممتازة التي تناقش طرق قياس الطيف الكتلي سابقا.

النتائج

الجدول 1: البلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة. تم ربط CycT1 و CDK9 في ناقلات البلازميد pcDNA / 4TO-STREP و pcDNA / 4TO-FLAG. تم تحويل هذه التركيبات إلى خلايا مختصة ب DH5α وطلاءها على ألواح LB-Ampicillin. تم اختيار المستعمرات وزراعتها وفحصها. تم التحقق من المستنسخة المربوطة بنجاح عن طريق تسلسل سانجر ومزيج من الهضم المقيد والرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. بالنسبة ل CycT1 ، استخدمنا إصدارا أقصر (1 - 708) بدلا من الطول الكامل (1 - 726) لأن آخر 18 بقايا تحتوي على تسلسل PEST (تسلسل ببتيد غني بالبرولين وحمض الج...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) فيشر ساينتيك SH30022FS مصل الأبقار الجنينية هيكلون SH30071 البنسلين / الستربتومايسين فيشر ساينتيك MP091670049 بولي جيت فيشر ساينتيك 50-478-8 كوكتيل مثبط البروتياز روش 11836153001 STREP-Tactin Superflow الرابطه 2-1208-010 المخزن المؤقت لشطف علامة STREP الرابطه 2-1000-025 EZview جل تقارب أحمر مضاد للعلم M2 سيغما SLBQ1981V كورنينج 100 مم × 20 مم نمط ثقافة خلية الطبق معالجة البوليسترين غير الحراري 20 / كم كورنينج 430167 بروتين لو بيند إيبندورف فيشر ساينتيك 13-698-794 خلاط دوامة رقمي فيشر ساينتيك 02-215-370 رف رغوة أنبوب صغير 48 حفرة فيشر ساينتيك 02-215-386 المشواة شاكر Labquake الحراريه هاتف: 415110