رنين البلازمون السطحي لدراسة التفاعلات الجزيئية الحيوية باستخدام شريحة مستشعر

Abstract

المصدر: Maier، I. العوامل المضادة للفيروسات الهندسية عبر رنين البلازمون السطحي. J. Vis. Exp. (2022)

يصف هذا الفيديو تقنية رنين البلازمون السطحي ، أو SPR ، لدراسة التفاعل بين جزيئين باستخدام شريحة مستشعر. يتم الكشف عن التغيير في زاوية الرنين وشدة الضوء المنعكس كدالة لارتباط وتفكك جزيئين ، وهذا يوفر معلومات حول التفاعلات بين الجزيئين.

Protocol

بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام بروتين اندماج معدل يشبه اليوبيكويتين الصغير CVN (SUMO) في فحوصات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم بدلا من CV-N وهو مناسب للمقايسات القائمة على الخلايا. يتم الحصول على بروتين HA H3 لفيروس الأنفلونزا A المؤتلف كامل الطول تجاريا (انظر جدول المواد) أو يتم التعبير عنه في خطوط خلايا HEK293 للثدييات وخلايا الحشرات المصابة بفيروس الباكولو وفقا للبروتوكولات القياسية. يتم التعبير عن بروتين سبايك ووهان -1 في خلايا HEK293 للثدييات. يسمح تخليق الببتيد mon-manosylated (MM) والببتيد ثنائي المانوسيلات (DM) بالكشف عن الروابط المتجانسة ل CVN2 والجزيئات الصغيرة أحادية المانوسيلات.

1. إنشاء بنيات CV-N

1. لكل من متغيرات CVN2 وبروتين CVN2L0 (PDB ID 3S3Y) ، احصل على بنية الجين بتسلسل زعيم الحوض الطرفي N وعلامة His-tag في متجه pET27b (+) من مصادر تجارية (انظر الجدول 1).
2. الحصول على CVN2L0 ومتغيراته (V2 و V3 و V4 و V5 ؛ الشكل 1 أ ، ج) في خلفية جين قالب CVN2L0 يتكون من تسلسلين متميزين للحمض النووي لكل تكرار CV-N.
3. قم بإذابة الحمض النووي البلازميد المجفف بالتجميد في الماء المقطر منزوع الأيونات المعقم (ddH₂O) إلى تركيز نهائي يبلغ 100 نانوغرام / ميكرولتر.

< p class = "jove_title" >2. تحضير ألواح LB-agar بالخلايا المحولة من الحمض النووي البلازميد

1. قم بإعداد وسط الاستزراع LB-Lennox عن طريق إذابة 10 جم / لتر من البيبتون ، و 5 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، و 5 جم / لتر من كلوريد الصوديوم في ddH₂O (انظر جدول المواد) ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. قم بإجراء التحويل إلى بكتريا قولونية مختصة BL21 (DE3) لكل متغير (V2-V5) بالطريقة الكيميائية بعد تقرير منشور سابقا.
2. قم بتقسيم المحلول (900 ميكرولتر و 100 ميكرولتر) ، وانقل 100 ميكرولتر على ألواح LB-agar (50 ميكروغرام / مل كاناميسين) ، واستخدم بلطف موزعة خلايا معقمة. احتضان ألواح الأجار طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >3. الاستنساخ

1. استنساخ الجين الخاص ب CV-N في مواقع NdeI و BamHI ل pET11a (انظر جدول المواد) للتحويل (التثقيب الكهربائي) إلى خلايا ذات كفاءة كهربائية بعد المرجع.

4. الطفرات الموجهة للموقع

1. لتوليد CVN2L0 و CVN-E41A المتحور في خلفية جين قالب CVN2L0 يحتوي على تسلسلين مميزين للحمض النووي لكل تكرار CV-N.
2. قم بعمل طفرات باستخدام مجموعة طفرات موجهة نحو الموقع (انظر جدول المواد) وبادئات مطفرة محددة 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' و 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgggttc-3' لتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
   1. ابدأ سلسلة من تفاعلات العينة باستخدام تركيزات متعددة من قالب الحمض النووي المزدوج الشريطة (dsDNA) تتراوح من 5-50 نانوغرام (على سبيل المثال ، 5 و 10 و 20 و 50 نانوغرام من قالب dsDNA). حافظ على ثبات تركيز التمهيدي.
      ملاحظه: يتم استخدام مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل وبروتوكول التدوير الحراري بشكل عام كما هو موضح في دليل التعليمات لمجموعة الطفرات الموجهة إلى الموقع.
3. أضف إنزيم تقييد DpnI (1 ميكرولتر ، 10 U / μL ، انظر جدول المواد) أسفل تراكب الزيت المعدني. امزج التفاعلات جيدا وبرفق ، وقم بالدوران في جهاز طرد مركزي دقيق على سطح الطاولة لمدة دقيقة واحدة ، واحتضانه على الفور عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لهضم dsDNA الفائق الالتفاف الأبوي.

فئة

5. تحويل الخلايا البكتيرية

1. قم بإذابة الخلايا فائقة الكفاءة XL1-Blue (انظر جدول المواد) برفق على الجليد. لتحويل كل تفاعل تحكم وعينة ، قم بتقسيم الخلايا فائقة الكفاءة (50 ميكرولتر) إلى أنبوب دائري القاع من مادة البولي بروبيلين المبردة مسبقا (14 مل).
   1. انقل 1 ميكرولتر من الحمض النووي أحادي الشريطة (ssDNA) المعالج ب Dpn I من كل تفاعل تحكم وعينة (ssDNA المتحور) لفصل حصص الخلايا فائقة الكفاءة ، والتي تصنع الخيط التكميلي. قم بتدوير تفاعلات التحويل بعناية لخلط واحتضان التفاعلات على الجليد لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظه: قبل نقل الحمض النووي المعالج ب Dpn I إلى تفاعل التحويل، يوصى بإزالة أي زيت معدني متبقي بعناية من طرف الماصة. كعنصر تحكم اختياري ، يجب التحقق من كفاءة التحويل للخلايا فائقة الكفاءة XL1-Blue عن طريق خلط 0.1 نانوغرام / ميكرولتر من بلازميد التحكم pUC18 (1 ميكرولتر) مع 50 ميكرولتر من الخلايا فائقة الكفاءة.
2. ضع نبضة الحرارة على تفاعلات التحويل عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، ثم ضع التفاعلات على الجليد لمدة دقيقتين < br / > ملاحظه: تم بالفعل تحسين نبضة الحرارة المطبقة للظروف المذكورة في أنابيب البولي بروبلين ذات القاع المستدير (14 مل).
3. أضف 0.5 مل من مرق NZY + (يحتوي على لتر واحد: 10 جم من أمين NZ (تحلل الكازين المائي ) ، 5 جم من مستخلص الخميرة ، 5 جم من كلوريد الصوديوم ، 12.5 مل من 1 م MgCl₂ ، 12.5 مل من 1 M MgSO₄ ، 10 مل من 2 M جلوكوز ، درجة الحموضة 7.5 ، ومحمى مسبقا إلى 42 درجة مئوية) واحتضان تفاعلات التحول عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 225-250 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة. لوحة الحجم الصحيح من كل تفاعل تحويل (5 ميكرولتر من تحويل البلازميد للتحكم ؛ 250 ميكرولتر من تحويل العينة) على ألواح أجار LB-ampicillin.
   ملاحظه: لضوابط التحول والطفرات ، انشر الخلايا على ألواح أجار LB-ampicillin التي تحتوي على 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal ، 80 ميكروغرام / مل) و isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG ، 20 مليمتر) (انظر جدول المواد). تلقيح 50 مل من مزارع الخلايا بمستعمرة واحدة من الخلايا الإشريكية القولونية المحولة لتنقية الحمض النووي البلازميد المتحور للتحليلات. يتم تأكيد الطفرات عن طريق تسلسل الحمض النووي في منشأة خارجية.

< ص الفئة = "jove_title">6. التعبير وتنقية البروتين

1. للحصول على ثقافة واسعة النطاق ، قم بتلقيح كمية صغيرة من LB (يحتوي على الأمبيسلين) بمستعمرة واحدة من اللوحة المحولة.
2. باستخدام الثقافة الليلية ، قم بتلقيح ثقافة التعبير بمواد مضافة ، مثل 10 ملي مولار من MgCl₂ ، و 10 ملي مولار من MgSO_{4 ،} و 20 ملي مولار من الجلوكوز ، مما يؤدي إلى تخفيف ثقافة البذور إلى 1/100.
   1. تنمو الخلايا مع اهتزاز قوي عند 37 درجة مئوية. قم بزراعة الخلايا إلى ABS 600 نانومتر بين 0.4-0.6 (مرحلة منتصف السجل) قبل تبريد الخلايا إلى 20 درجة مئوية.
   2. بعد ذلك ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
3. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وأعد الطرد المركزي عند 4,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ثم تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة. أعد تعليق الحبيبات المتبقية في 10 مل من المخزن المؤقت للتحلل واحتضان التعليق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظه: تكوين المخزن المؤقت للتحلل: (50 ملي مولار من NaH₂PO₄ ، 300 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ، 2٪ تريتون-X 100 ، 500 نانوغرام / مل من الليزوزيم ، 1 ملي مولار من فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) ، 1 ملي مولار من ثنائي ثيوثريتول ، 1 ملي مولار من MgCl₂ ، درجة الحهيدروضة 8 ، انظر جدول المواد).
   1. أخضع الخليط لدورتين من التجميد والذوبان (-80 درجة مئوية). افصل الأجزاء القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي عند 4,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وقم بتحليلها باستخدام الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد (PAGE) ، على وجه الخصوص ، كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) - PAGE (الشكل 1 ب ، ج).
      ملاحظه: يمكن تحلل الخلايا بعدة طرق ، مثل التجميد والذوبان ، أو الصوتنة ، أو التجانس ، أو التحلل الأنزيمي ، أو مزيج من هذه الطرق. يوصى بالتنقية من الهيئات المضمنة لجمع غلة عالية من البروتين.
4. تنقية البروتينات باستخدام كروماتوغرافيا عمود Ni-NTA (انظر جدول المواد). قم بتحميل الجزء القابل للذوبان على عمود حبة Ni-NTA المتجدد (1 مل / دقيقة). اغسل النظام بمخزن TBS المؤقت (50 ملي مولار من تريس ، 150 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5) قبل البدء في التدرج (0-100٪ 500 ملي إيميدازول في TBS على مدى 60 دقيقة) وجمع الكسور (1 مل / دقيقة). غسيل البروتينات المنقاة للتوصيف الكيميائي الحيوي مقابل 100 ملي مولار PBS (الشكل 1 ج ، د).
5. بدلا من ذلك ، استخدم هلام التقارب His-Select Ni²⁺ (انظر جدول المواد) في أنابيب سعة 14 مل لربط وإعادة تعليق CV-N المعبر عنه مؤتلفا في محاليل عازلة مع 20 ملي مولار إيميدازول و 250 ملي مولار إيميدازول ، على التوالي. احتضن دفعة واحدة لمدة 30 دقيقة على الأقل
   ملاحظه: قم بتطبيق هذه البروتينات شبه النقية على عمود معبأ مسبقا للاستخدام مرة واحدة لتبادل المخزن المؤقت وتنظيف العينات البيولوجية ، على سبيل المثال ، الكربوهيدرات والبروتينات ، والتي يمكن أن تحمل 1-1.5 مل تشطف من كروماتوغرافيا تقارب المعادن المجمدة.
6. انقل محاليل البروتين إلى أنابيب الطرد المركزي باستخدام مرشح قطع 10 كيلو دالتون (انظر جدول المواد) وركزها عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 4,500 × جم و 4 درجات مئوية. لقياسات SPR ، استبدل المحاليل التحليلية إلى 10 ملي مولار HEPES ، و 150 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، و 3 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، و 0.05٪ Tween20 ، الرقم الهيدروجيني 7.4 (HBS-EP (+) ، انظر جدول المواد).
   1. أضف هذا المخزن المؤقت لتشغيل SPR إلى عامل تخفيف قدره 1:10 وجهاز الطرد المركزي أربع مرات إلى الحجم الأولي لمدة 10 دقائق عند 4,500 × جم و 4 درجات مئوية.
7. حدد تركيز البروتين عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop UV-Vis (انظر جدول المواد) بناء على معامل الانقراض المحسوب (20،440 ^{M-1 cm-1}) للبروتين الرئيسي CVN2L0 الذي يظهر حجم 23،474 Da. استخدم PBS (100 ملي مولار ، الرقم الهيدروجيني 7.0) أو المخزن المؤقت SPR كفارغ ، وقم بقياس تركيز البروتين بثلاث خطوات تخفيف (1: 1 ، 1:10 و 1:100).

فئة

7. التحليل الطيفي SPR

1. استخدم نظام SPR ثنائي القناة (انظر جدول المواد) مع تشغيل المخزن المؤقت HBS-EP (+) و 10 ملي مولار جلايسين حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 1.5-1.6 كمخزن مؤقت للتجديد. قم بتشغيل الأداة ، ومزيل الغاز ، وأخذ العينات التلقائية ، والمضخة ، واغسل النظام بأكمله باستخدام ddH₂0 لمدة 1 ساعة. ضع مخزن التخزين المؤقت الجاهز للاستخدام في زجاجة منفصلة.
2. قم بإسقاط زيت الغمر على الكاشف وقم بتركيب شريحة مستشعر زجاجية (انظر جدول المواد) مطلية بغشاء ذهبي رقيق وعلى الجانب العلوي تعمل باستخدام هيدروجيل كربوكسي ميثيل ديكستران مباشرة على الكاشف أسفل خلية التدفق ثلاثية المنافذ. قم بإصلاح الإعداد عن طريق سحب المناولة.
   ملاحظه: C19RBDHC30M 200 نانومتر ستربتافيدين مشتق من كربوكسي ميثيل ديكستران هيدروجيل مع كثافة متوسطة من بروتين فيروس كورونا -2 RBD المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة البيوتينيل ، هو عبارة عن شريحة استشعار جاهزة للاستخدام مع الترابط الثابت مسبقا.

فئة

8. اختبار ربط SPR لربط CV-N ببروتين HA و S و RBD

1. قم بتثبيت الروابط البروتينية لرقائق الاستشعار باتباع الخطوات أدناه.
   1. افتح جدول تشغيل بالنقر فوق نموذج في شريط القائمة وتشغيل محرر الجدول في برنامج SPRAutoLink المدمج (انظر جدول المواد). اختر وانقر فوق BASIC_Immobilization من قائمة جداول التشغيل المتاحة واتبع خطوات الإجراء التجريبي على شاشة الكمبيوتر. يتم عرض محرر النموذج المعني المستخدم في الزاوية العلوية اليمنى.
   2. انقر فوق محرر مجموعة العينات في قسم النموذج لملء قائمة الكواشف لرففين موضوعين في جهاز أخذ العينات التلقائي لمزيد من التحليلات. انقر فوق Autosampler Direct Control ك "أداة" في شريط القائمة لإحضار الرفوف إلى الأمام أو العودة إلى المنزل. اختر 4 درجات مئوية كدرجة حرارة التشغيل.
      ملاحظه: يسمح برنامج SPR ب "التحكم المباشر في أداة SPR" و "التحكم المباشر في المضخة" عن طريق تحديد الأدوات المقابلة ، بالإضافة إلى معالجة أخذ العينات التلقائية ، والنقر فوق النموذج ؛ يمكن أيضا اختيار تشغيل محرر الجدول أو مخطط البيانات أو المعالجة اللاحقة لإجراء تحليل البيانات. يتم حفظ الملفات مباشرة في الدليل الافتراضي ويتم تصديرها ك scrubber.files من نافذة Post-Processing.
2. ابدأ تشغيل المضخة لبث ddH₂0 بالنقر فوق أدوات ومضخة التحكم المباشر وتسجيل البيانات بالنقر فوق SPR Instrument Direct Control ، وفي كل مرة ابدأ في النوافذ التي تظهر حديثا. ضع كواشف التوصيل (الخطوة 8.3) في قارورة سعة 300 ميكرولتر ، وضعها في رفوف أخذ العينات التلقائية ، وابدأ جدول التشغيل بالنقر فوق Run.
   ملاحظه: يتم تكييف أسطح الرقائق إما بدرجة حموضة عازلة جلايسين 10 ملي مولار 9.0 أو ربما تم شطفها باستخدام 1 م كلوريد الصوديوم ، 0.1 م بورات الصوديوم عازلة الأس الهيدروجيني 9.0 لتكييف سطح الرقاقة المشتق من الكربوكسيل لمزيج تنشيط EDC / NHS.
3. لهذا التفاعل البسيط بين البروتين والبروتين ، استخدم شريحة CMD500D (انظر جدول المواد) لتوليد وحدة معامل الانكسار الدقيق (μRIU) = 2500 - 3000 خلية تدفق مع HA الثابت و μRIU = 400 خلية تدفق مع بروتين سبايك. بمعدل تدفق نقع يبلغ 15 ميكرولتر / دقيقة ، قم بحقن خليط مائي ومتساو من 0.4 M N-ethyl-N'- (ثنائي ميثيل أمينو بروبيل) كاربوديميد هيدروكلوريد (EDC * HCl) و 0.1 M N-hydroxysuccinimide (NHS) عن طريق تطبيق الخطوات المتسلسلة التالية.
   1. إعادة تعبئة مضخة إعادة التعبئة عند 25,000 ميكرولتر / دقيقة ، وإجراء تعديل خط الأساس لمدة 30 ثانية ، وحقن 90 ميكرولتر من محلول تنشيط العينة (EDC / NHS) على مدى 6 دقائق من وقت التلامس ، ثم الاستمرار لمدة 5 دقائق أخرى.
   2. كرر هذه الدورة بعد تشغيل خط الأساس لمدة دقيقة واحدة عند 10 ميكرولتر / دقيقة على خلية التدفق اليسرى فقط (الأزرق) لحقن وتثبيت الببتيدات المركبة كيميائيا ، HA ، وبروتين سبايك عند 20 ميكروغرام / مل ، والسماح بتعديل خط الأساس اللاحق مع ddH₂O لمدة 1.5 دقيقة قبل إخماد سطح الرقاقة المنشط ب 1 M ethanolamine HCl pH 8.5.
4. قم بتبديل الأنابيب من جهاز أخذ العينات السائل إلى مزيل الغابات من ddH₂0 إلى الزجاجة باستخدام HBS-EP (+) (الشكل 2).
5. تحليل مخططات استشعار SPR.
   1. لإجراء الدراسات الحركية ، استخدم تركيزات تحليلية مختلفة (10-5-10-8 م) ، مع خطوة تجديد بعد كل حقنة وقياسات فارغة بعد تحليلات مختلفة. قم بتغيير معدل التدفق إلى 10 ميكرولتر / دقيقة وابدأ الحقن لمدة 4 دقائق من وقت التلامس ، ثم 5 دقائق من إنشاء خط الأساس ، وخطوتي تجديد لمدة 2 دقيقة لكل منهما بفاصل 30 ثانية.
   2. حقن المحلول العازل للقياسات الفارغة التي يتم طرح أجهزة الاستشعار الخاصة بها من تشغيل العينة لتطبيع تركيزات البروتين المختلفة.
6. انقر فوق نموذج ، وقم بالتمرير لأسفل ، وقم بالتغيير إلى "المعالجة اللاحقة" بالنقر فوق وضع العملية هذا. انقر فوق إضافة لتحديد منحنيات الربط التي تم إنشاؤها بمرور الوقت في نموذج مخطط البيانات لكل خلية تدفق ، وقم بتصدير التراكب كملف تنظيفية (.ovr). انقر فوق ملف لفتح خيارات حفظ الملفات. احصل على منحنيات الاستجابة عن طريق محاذاة المنحنيات اليمنى واليسرى وطرح إشارات القناة المرجعية الثانية من تلك الموجودة في قناة الترابط.
   ملاحظه: يتم تشغيل البيانات في "المعالجة اللاحقة" عن طريق تعريف أجهزة الاستشعار حسابيا. يتم وضعها في تراكب من أجهزة الاستشعار من خلايا التدفق اليمنى واليسرى ، أو يتم تمثيلها على أنها مخططات استشعار من اختلاف كلتا القناتين.
7. قم بتنظيف السوائل بأكملها بمحلول 50-100 ملي مولار من الجلايسين ، ودرجة الحموضة 9.5 ، والماء ، و 20٪ إيثانول قبل وبعد قياسات الربط لإزالة آثار الملح أو أي تلوث بروتيني ، أو أكثر صرامة ، مع 0.5٪ SDS و glycine.
   ملاحظه: لمنع تلف الجهاز ، يوصى بالتحقق من الاستقرار الميكانيكي للرقاقة الزجاجية قبل إعادة إدخال خرطوشة الشريحة في الجهاز إذا تم تخزين الرقائق تحت مخزن مؤقت أو عند رطوبة 100٪.

الجدول 1: البيانات الحركية التي تم الحصول عليها من مخططات استشعار SPR لربط متغيرات رابطة CVN2L0 و Cys-Cys V2 و V4 و V5 إلى HA باستخدام نموذج ربط Langmuir 1: 1. K_D [M] = k_off / k_on أو k_d / k_a. يتم إنشاء جميع البيانات عند 25 درجة مئوية في المخزن المؤقت HBS-EP (+).

أناليت ك_على [^M-1*^ق-1] ك_{إيقاف [}^S-1] كيه_د CVN2L0 5.1 ه3 1.3 [^إ-3] 255 نانومتر الخامس2 4.0 e3 1.1 [^إ-3] 275 نانومتر الخامس 4 1.2 [إ3] 1.3 [^إ-3] 11 ميكرومتر الخامس5 1.2 [إ3] 5.8 [^إ-2] 5 ميكرومتر

Results

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تسلسل CV-N والتعبير. (أ) يتم التعبير عن CVN2 بدون رابط بين كل تكرار CV-N (101 من الأحماض الأمينية لكل منهما) وأربعة جسور ثاني كبريتيد في متجه pET11a في E. القولونية. (ب) تعبيرات مستعمرتين مستقلتين ل CV-N (مونومر) و CVN2 (ثنائي). (ج) يتم تنقية متغيرات رابطة ثاني كبريتيد وتحليلها على SDS-PAGE. يتم استخدام علامة الو...

Materials