الرنين المغناطيسي النووي لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين على المستوى الذري

الملخص

المصدر: Winkelaar, G., et al. قياس تفاعلات البروتينات الكروية والخيوطية عن طريق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) والرحلان الحراري المجهري (MST). J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو تقنية التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين بين ¹⁵بروتينا من النوع البري والمتحور من النوع N وبروتين الفيمنتين غير المسمى. يؤدي التفاعل الناجح بين envoplakin و vimentin من النوع البري إلى توسيع الخط على نطاق واسع واختفاء الذروة في أطياف الرنين المغناطيسي النووي ، في حين أن عدم وجود تفاعل بين envoplakin و vimentin المتحور يؤدي إلى قمم جيدة الحل في أطياف الرنين المغناطيسي النووي.

البروتوكول

1. طرق الرنين المغناطيسي

النووي

1. تحضير عينة الرنين المغناطيسي النووي
   1. قم بتنقية ¹⁵بروتين من النوع البري أو R1914E E-PRD باستخدام 20 ملي مولار Tris-HCl ، 1 ملي مولار DTT ، درجة الحموضة 7. تتراوح محاليل مخزون البروتين عادة من 0.3 إلى 1 ملي مولار بأحجام تبلغ حوالي 1 مل < br / > ملاحظه: يمكن تركيز البروتين إلى >100 ميكرومتر باستخدام جهاز الترشيح الفائق بالطرد المركزي MWCO 3 كيلو دالتون ، 5 مل لجعل التركيز في نطاق مناسب لإعداد العينة.
   2. قم بتنقية عينة من بروتين VimRod غير المسمى باستخدام 20 ملي Tris-HCl ، 1 ملي مولار DTT ، درجة الحموضة 7.
   3. في الحجم النهائي البالغ 500 ميكرولتر ، أضف بروتين E-PRD من النوع البري أو المتحور إلى التركيز النهائي البالغ 100 ميكرومتر ، وأكسيد الديوتيريوم (D₂O) إلى التركيز النهائي 10٪ (v / v) ، و DSS (4،4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid) إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ميكرومتر. ارفع حجم العينة إلى 500 ميكرولتر باستخدام 20 ملي مولار Tris-HCl ، 1 ملي DTT ، ودرجة الحموضة 7. يتم وصف إعداد العينة التمثيلية في الجدول 1.
      ملاحظه: يتم استخدام الرنين 0 جزء في المليون ل DSS لمعايرة التحولات الكيميائية ¹H وكذلك للإشارة غير المباشرة للتحولات الكيميائية ¹⁵N للبروتين. يستخدم D₂O لإشارة قفل الديوتيريوم للحفاظ على عمل مقياس الطيف في مجال مغناطيسي صافي ثابت.
   4. قم بتكوين عينة ثانية من E-PRD و D₂O و DSS كما في الخطوة السابقة وأضف VimRod إلى تركيز نهائي يبلغ 50 ميكرومتر قبل رفع الحجم إلى 500 ميكرولتر.
   5. انقل العينات سعة 500 ميكرولتر إلى أنابيب الرنين المغناطيسي النووي بعرض 5 مم للتجربة.

2. الإعداد التجريبي للرنين المغناطيسي

النووي

1. قم بتشغيل تدفق الهواء باستخدام الأمر إخراج "ej" ؛ سيؤدي ذلك إلى رفع العينة من المغناطيس. الآن ، ضع العينة داخل دوار أعلى المغناطيس بواسطة الفتحة وأدخلها بالأمر "ij". انتظر حتى تستقر العينة داخل المغناطيس قبل المتابعة.
2. قم بإنشاء مجموعة بيانات جديدة باستخدام الأمر "edc" وقم بتحميل معلمات الرنين المغناطيسي النووي القياسية ¹H عن طريق تحديد التجربة "ZGPR" (الشكل 1). املأ حقول NAME و EXPNO (رقم التجربة) و PROCNO (رقم مجلد البيانات المعالجة). حدد المذيب في حقل "تعيين المذيب" وانقر على "تنفيذ" getprosol "لقراءة رأس المسبار القياسي والمعلمات المعتمدة على المذيبات (prosol).
3. قم بقفل العينة في المذيب المنزوع ، أي D₂O ، باستخدام الأمر "lock" وانتظر حتى تنتهي من الكنس وتحقيق القفل.
4. قم بتصحيح تردد الرنين للمغناطيس عن طريق ضبط العينة باستخدام أمر الضبط التلقائي "atma". راقب منحنى التذبذب حتى يكتمل الضبط التلقائي.
5. قم بتقطيع المجال المغناطيسي باستخدام TOPSHIM (الأمر "topshim"). Shimming هو عملية التعديلات على المجال المغناطيسي لتحقيق التوحيد حول العينة. من الممارسات الجيدة تخزين قيم الرقائق باستخدام الأمر "wsh" وقراءتها باستخدام "rsh" قبل topshim ، إذا كنت تستخدم نفس العينات أو عينات مماثلة.
6. اضبط كسب جهاز الاستقبال باستخدام الأمر "rga" لتحقيق أقصى نسبة إشارة إلى ضوضاء.
7. ضع مركز الطيف على إزاحة رنين الماء (o1) واضبط نبضة البروتون 90 درجة (p1) على طاقة عالية باستخدام "calibo1p1".
8. اجمع طيف البروتون باستخدام الأمر والعملية zero go "zg" باستخدام "efp" والذي يتضمن الضرب الأسي ("em") ، واضمحلال الحث الحر (FID) الذي يتضمن توسيع الخط ، وتحويل فورييه "ft" ل FID و "pk" لتطبيق تصحيح الطور.
9. قم بتطبيق تصحيح الطور التلقائي "apk" والتصحيح الأساسي التلقائي "absn" باستخدام خيار كثيرات الحدود بدون تكامل.
10. قم بإنشاء مجموعة بيانات جديدة (كما في 1.2.2) لتجربة SOFAST HMQC عن طريق تحديد "SFHMQC3GPPH" في التجربة.
11. انسخ P1 و O1 المحسنة من طيف البروتون وقم بملء النبضات المعتمدة على P1 باستخدام الأمر "getprosol 1H p1 plw1" ، حيث p1 هي قيمة P1 المحسنة و plw1 هي مستوى القدرة ل P1.
12. قم بتحسين ثابت CNST54 لضبط الإزاحة للتحول الكيميائي للأميد و CNST55 لتحديد عرض النطاق الترددي من أجل تضمين المناطق الطيفية ذات الأهمية التي تسمح بتحسين كسب المستقبل (الشكل 2). لتحديد هذه المعلمات ، استخرج أول FID (اضمحلال الحث الحر) من الطيف ثنائي الأبعاد وابحث عن الإشارة المرصودة لتحديدها. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتغيير تأخير الاسترخاء (D1) وعدد عمليات المسح (NS) والمسح الوهمي (DS) للحصول على حساسية إشارة مقبولة باستخدام الأمر "gs" ، والذي يتيح الانتقال والمسح الضوئي لمراقبة جودة البيانات في الوقت الفعلي.
13. سجل الأطياف باستخدام Zero Go "zg".

< p class = "jove_content" > الجدول 1. تحضير عينة الرنين المغناطيسي النووي.

عينة 1 ملي مولار E-PRD في المخزن المؤقت A (μL) 1 ملي مولار VimRod في المخزن المؤقت A¹ (μL) المخزن المؤقت أ (ميكرولتر) 200 ميكرومتر DSS في D₂O (ميكرولتر) المخزن المؤقت ب² (ميكرولتر) الحجم الكلي (ميكرولتر) E-PRD وحده 50 0 50 50 350 ريال 500 جنيه E-PRD + VimRod 50 50 0 50 350 ريال 500 جنيه ¹المخزن المؤقت أ: 20 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ، 1 ملي مولار DTT ، درجة الحموضة 7 ²المخزن المؤقت B: 23 ملي مولار Tris-HCl ، 1.14 ملي DTT ، الرقم الهيدروجيني 7

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التقاط الشاشة لإعداد تجربة الرنين المغناطيسي النووي. يتم استخدام النافذة المعروضة لإعداد تجربة قياسية لتجميع مجموعة بيانات HSQC. تتم قراءة معلمات التجربة بجوار التجربة. تم اختيار تجربة ZGPR الموضحة كتجربة أولية لتحميل معلمات البروتون القياسية والمعتمدة على المذيبات. يتم استخدام نافذة العنوان لإدخال التفاصيل التجريبية لأغراض حفظ السجلات. لجمع طيف HSQC ، يتم استبدال تجربة ZGPR ب SFH...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كلوريد الأمونيوم (¹⁵نيوتن ، 99٪) مختبرات كامبريدج للنظائر NLM-467 وضع العلامات على النظائر للرنين المغناطيسي النووي D₂O ، أكسيد الديوتيريوم (D ، 99.8٪) مختبرات كامبريدج للنظائر DLM-2259 تحضير عينة الرنين المغناطيسي النووي DSS ، الصوديوم 2،2-ثنائي ميثيل -2- سيلابنتان -5-سلفونات -D6 (D ، 98٪) مختبرات كامبريدج للنظائر دي إم -8206 مرجع الرنين المغناطيسي النووي أنابيب الرنين المغناطيسي النووي الدقيقة 5 مم ، بطول 7 بوصات SJM / Deuterotubes بورويكو -5-7 أنابيب الرنين المغناطيسي النووي مطياف الرنين المغناطيسي النووي (14.1 تسلا) بروكر الحصول على بيانات الرنين المغناطيسي النووي مسبار TCI 5mm z-PFG المبرد بروكر الحصول على بيانات الرنين المغناطيسي النووي برمجيات بروكر توب سبين 4.0.1 بروكر معالجة بيانات الرنين المغناطيسي النووي