مقالة منهجية

استخدام شاشة العاثية لتحديد البروتينات ذات التقارب العالي مع البروتين المستهدف

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Zhang ، W. ، et al. ، باستخدام عرض العاثيات لتطوير معدلات متغيرة Ubiquitin ل E3 ligases. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية عرض العاثيات لعزل العاثيات المصممة مسبقا التي تعبر عن البروتينات ذات التقارب العالي مع البروتين المستهدف.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد مكتبة العاثيات

  1. قم بإذابة مكتبة العاثيات على الجليد وقم بتخفيفها إلى 100 ضعف تنوع المكتبة في PBS. على سبيل المثال ، إذا كان تنوع المكتبة 1 × 1010 وتركيز المكتبة 1 × 1013 ، فقم بتخفيف المكتبة بحيث يكون التركيز 1 × 1012. بالنسبة للمكتبات المستخدمة هنا ، قم بتخفيفها 10 أضعاف في PBS عن طريق الجمع بين 1 مل من المكتبة مع 9 مل من PBS.
    ملاحظه: كان من المفترض أن يتم تحديد تنوع المكتبات أثناء إنشاء المكتبة ولا يمكن تقييمه بسهولة بطريقة أخرى. يمكن تحديد تركيز المكتبة عن طريق تلقيح بكتريا قولونية الخلايا في مرحلة منتصف السجل (OD600 figure-protocol-1 0.6 - 0.8) والطلاء على LB / carb.
  2. أضف 1/5 حجم من PEG / كلوريد الصوديوم. على سبيل المثال ، بالنسبة ل 10 مل من المكتبة المخففة مسبقا ، أضف 2 مل من PEG / NaCl.
  3. احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة.
  4. جهاز طرد مركزي عند 11,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين لسحب المادة الطافية المتبقية.
    ملاحظه: ضع الأنبوب في الدوار في نفس الاتجاه في المرة الثانية حيث كان أول من احتفظ بالحبيبات في نفس المكان ، مما يسهل رؤيتها.
  5. أعد تعليق حبيبات العاثية برفق في 1 مل من PBT لكل بروتين. بالنسبة لأربعة بروتينات ، أعد تعليق الحبيبات في 4 مل من PBT.
    ملاحظه: حاول ألا تلمس الحبيبات ولا تدخل فقاعات الهواء.
< p class = "jove_title" >2. عرض العاثية على البروتين (البروتينات) المستهدفة
  1. التحكم الاختياري: أضف 100 ميكرولتر من مكتبة العاثيات إلى كل بئر مغلف في لوحة التحكم. احتضان في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية) لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة وانقل المكتبة من لوحة التحكم إلى اللوحة المستهدفة.
  2. قم بإزالة المخزن المؤقت PB من اللوحة المستهدفة وأضف 100 ميكرولتر من مكتبة العاثيات إلى كل بئر مطلي.
  3. احتضان في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة.
< p class = "jove_title" >3. Elute جولة واحدة
  1. قم بإزالة مكتبة العاثيات واغسل الآبار المطلية أربع مرات باستخدام عازلة PT. اقلب الطبق واضغط على منشفة ورقية لإزالة القطرات الأخيرة.
    ملاحظه: إذا تم طلاء بروتينات مستهدفة متعددة على لوحة واحدة ، فحاول تقليل تدفق جميع المحاليل اللاحقة بين الآبار.
  2. أضف 100 ميكرولتر من 0.1 م حمض الهيدروكلوريك إلى كل بئر مطلي واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة.
  3. قم بتحييد الرقم الهيدروجيني عن طريق إضافة 12.5 ميكرولتر من 1 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 11) إلى كل بئر مطلي.
  4. قم بتجميع العاثية المملوءة من جميع الآبار الثمانية في أنبوب واحد للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل. الماصة لأعلى ولأسفل أثناء النقل لجعل المحاليل متجانسة وشفط كل السوائل من الآبار.
  5. أضف 10٪ BSA إلى العاثية المملوءة المجمعة إلى تركيز نهائي قدره 1٪. للحصول على حجم شطف نموذجي من الجولة الأولى يبلغ 950 ميكرولتر ، أضف 95 ميكرولتر من 10٪ BSA. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. هذا هو إخراج الجولة الأولى.

4. التحضير لجولات الاختيار اللاحقة

  1. قم بإعداد ثقافة البذور لزراعة مدخلات العاثيات للجولة التالية من الاختيار كما في الخطوة 1.1.
  2. قم بتغطية اللوحة للجولة الثالثة من الاختيار كما في الخطوة 1.2 بالتغييرات المذكورة أدناه.
    1. قم بتغطية أربعة آبار فقط لكل بروتين في طبق ربط 96 بئرا. استخدم نصف محتويات أنابيب "الجولة 2/3" أو "الجولة 4/5" للجولة المناسبة. قم بتخفيف محتويات هذه الأنابيب حسب الحاجة ، لتجنب استقرار البروتينات خارج المحلول.
  3. قم بإعداد إدخال العاثية للجولة التالية من الاختيار.
    1. استخدم نصف الإخراج الدائري لتلقيح 3 مل من خلايا الطور المتوسط. للحصول على إخراج نموذجي ، قم بالتلقيح ب 500 ميكرولتر من الإخراج.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة.
    3. أضف العاثية المساعدة M13K07 إلى التركيز النهائي 1 × 1010 PFU / مل.
    4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة.
    5. انقل 3 مل من المزرعة بالكامل إلى 30 مل من 2YT / carb / kan. تنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات نظام الأنبوب الصغير Axygen (0.65 مل ، معقم ، 96 / رف ، 10 رفوف / عبوة) فيشر ساينتيك 14-222-198 أدوات بلاستيكية وسائط الثقافة المجففة BD Difco: مرق LB ، ميلر (لوريا بيرتاني) فيشر ساينتيك DF0446-17-3 تحضير الأطباق للمعايرة ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، الكسر الخامس بيو شوب كندا ألب 001 مكون المخزن المؤقت ملح كاربينيسيلين ثنائي الصوديوم 89.0-100.5٪ لا مائي ميليبور سيجما C1389-5G زراعة الخلايا المصابة بالعفاجيميد شاكر رقيق رقمي مدمج فيشر ساينتيك 11-676-337 جهاز Corning Microplate الألومنيوم الختم الشريط فيشر ساينتيك 07-200-684 ختم مخزون الجلسرين العاثية أجار مجفف فيشر ساينتيك DF0140-01-0 تحضير الأطباق للمعايرة DS-11 مقياس الطيف الضوئي / مقياس الفلور دينوفيكس DS-11 FX+ جهاز Greiner Bio-One CellStar 96-Well ، غير معالج ، على شكل حرف U ، صفيحة صغيرة فيشر ساينتيك 7000133 أدوات بلاستيكية حمض الهيدروكلوريك فيشر ساينتيك أ 144-500 كيميائي Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R بكتريا قولونية مختصة كيميائيا فيشر ساينتيك C854003 سلالة بكتيرية لعدوى العاثيات كبريتات كاناميسين فيشر ساينتيك AAJ1792406 زراعة الخلايا المصابة بالعاثيات المساعدة M13K07 M13KO7 مساعد العاثية نيو إنجلاند بيولابيس N0315S السماح التعبئة والإفراز phagemid MaxQ 4000 منضدة المدارية شاكر فيشر ساينتيك 11-676-076 جهاز Nunc MaxiSorp 96 بئر ميكروبليت ، قاع مسطح تقنيات الحياة 44-2404-21 أدوات بلاستيكية محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 10X فيشر ساينتيك ص3994 مكون المخزن المؤقت / وسيط إعادة تعليق العاثية أفلام البوليستر ل ELISA والحضانة VWR 60941-120 تغطية الألواح الدقيقة أثناء الحضانة البولي إيثيلين جلايكول 8000 (PEG) فيشر ساينتيك بي ت 233-1 ترسيب العاثية كلوريد الصوديوم ميليبور سيجما S3014 ترسيب العاثية أنابيب ثقافة بلاستيكية معقمة: مادة البولي بروبيلين الشفافة فيشر ساينتيك 14-956-1 د استزراع مدخلات العاثيات التتراسيكلين هيدروكلوريد فيشر ساينتيك ص912-100 زراعة بكتريا قولونية خلايا OmniMax قاعدة تريس فيشر ساينتيك ص1525 تحييد محلول العاثيات المملوءة مسحوق التربتون فيشر ساينتيك ص1421-2 مكون وسائط نمو الخلية توين 20 فيشر ساينتيك BP337500 مكون المخزن المؤقت مستخلص الخميرة فيشر ساينتيك ص1422-2 مكون وسائط نمو الخلية

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة