التحليل الطيفي لتذبذب التألق لدراسة القلة المتجانسة للبروتين

فئة

1. تنقية FKBP12 F36V -mVenus

1. تحويل (DE3) خلايا pLysS مع متجه pET22b الذي يحتوي على FKBP12F36V12 بشري أحادي وعلامات His6 و mVenus الطرفية N (المتجه متاح عند الطلب). خلايا صفيحة على أجار LB مكملة ب 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين و 34 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول.
2. نقل المستعمرات المحولة إلى 100 مل مزرعة بداية رطل وتنمو لمدة 16-20 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الرج.
3. تمييع ثقافة البداية الكثيفة (OD600 >1) 1: 100 في وسط رطل (دفعات 2 × 500 مل) وتنمو لمدة 2-3 ساعات إلى OD600 = 0.6 - 0.8 (37 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة).
4. ثقافات باردة على الجليد. تحفز ب 250 ميكرومتر IPTG وتنمو لمدة 16-20 ساعة عند 21 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة.
5. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة 20 دقيقة.
6. أعد تعليق الحبيبات في 40 مل من المخزن المؤقت IMAC A (20 ملي فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 500 ملي كلوريد الصوديوم ، 3 ملي مولار إيميدازول ، 1 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول) مكملة بمثبطات البروتياز الخالية من EDTA (1 قرص لكل حبيبات خلية).
7. خلايا صوتية (500 واط ، 20 كيلو هرتز ، سعة 40٪ ، 9 ثوان ، 11 ثانية لمدة 15 دقيقة) على الجليد وحصاد المواد القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي عند 20,000 × جم.
8. انقل المحللة القابلة للذوبان إلى قارورة مخروطية الشكل وأضف 2 مل من الراتنج (انظر جدول المواد). احتضان لمدة 1 ساعة مع دوران 105 دورة في الدقيقة
   ملاحظه: يمكن أيضا استخدام سيفاروز النيكل في خطوة IMAC هذه.
9. حصاد الراتنج وغسله ب 250 مل من المخزن المؤقت IMAC A متبوعا ب 500 مل من المخزن المؤقت IMAC B (20 ملي فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 500 ملي كلوريد الصوديوم ، 7 ملي مولار إيميدازول ، 1 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول).
   ملاحظه: قم بزيادة إلى 50 ملي مولار إيميدازول إذا كنت تستخدم راتنج النيكل سيفاروز.
10. Elute His6-tagged البروتين باستخدام IMAC buffer C (20 ملي فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 500 ملي كلوريد الصوديوم ، 300 ملي إيميدازول ، 1 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول).
11. حقن في عمود استبعاد الحجم (انظر جدول المواد) متوازن في 10 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7.5 و 150 ملي كلوريد الصوديوم و 1 ملي مولار DTT. FKBP12F36V له ذروة شطفه عند 87.71 مل على العمود الذي استخدمناه.
12. قم بتقييم النقاء عبر SDS-PAGE وقم بالتجميع والتركيز حسب الحاجة.

< p class = "jove_title" >2. إعداد مصفوفة لوحة متعددة الآبار

1. قم بإذابة FKBP12F36V المنقى (أو البروتين المسمى ذي الأهمية) من -80 درجة مئوية.
2. تحضير محلول من 100 نانومتر FKBP12F36V منقى (متوسط ، 10 ملي مولار هيبس ، درجة الحموضة 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي بالتوقيت العالمي للتكنولوجيا). صوتيا وأجهزة الطرد المركزي (دوران سريع 13,000 دورة في الدقيقة) لمنع تكوين الركام.
3. ماصة 100 - 200 ميكرولتر في غرفة مراقبة مكونة من 8 آبار ذات قاع زجاجي.
4. أضف ثنائي الميكروبيد BB إلى التركيزات النهائية 10 و 20 و 40 و 80 و 100 و 150 و 300 و 500 نانومتر.
5. كمرجع ، قم بإعداد محلول 100 نانومتر من mVenus وحده لتقييم تأثيرات التجميع وهطول الأمطار المحتملة واستعادة قيمة السطوع للمونومر بنفس إعدادات الاستحواذ.

< p class = "jove_title" >3. اكتساب متحد البؤر خال من المعايرة

1. ابدأ النظام متحد البؤر (الشكل 1). أي نظام متحد البؤر لمجهر المسح الضوئي المجهز بكاشفات رقمية أو كاشفات تناظرية جيدة التميز ، وقادر على الحفاظ على وقت مكوث ثابت لكل بكسل يتم الحصول عليه.
2. اضبط مسار شعاع الإثارة:
   1. قم بتشغيل ليزر 514 نانومتر واضبطه على 20 - 100 نيوتن واط الطاقة عند الخروج من الهدف (ل FKBP12F36V-mVenus).
   2. حدد هدف 63X1.4NA أو هدف الغمر في الماء لتصحيح الياقة المصمم ل FCS.
   3. قم بتشغيل كاشف HyD أو APD أو PMT معاير. يفضل استخدام أجهزة الكشف القادرة على عد الفوتون ، كما هو الحال في هذه الحالة ، لا يلزم حساب S والإزاحة σ₀².
   4. حدد نافذة البث من 520 - 560 نانومتر
   5. اضبط الثقب على 1 وحدة Airy للانبعاث المقابل ~ 545 نانومتر.
   6. اضبط وضع الاستحواذ على 16 × 16 بكسل
   7. اضبط وقت سكون البكسل بحيث يرضي _الإطار t >> T_D >> t_، حيث T_D هو وقت إقامة البروتين المنتشر _{والإطار} t هو معدل الإطارات. يتوافق هذا مع ضبط وقت السكون على ~ 13 ميكرو ثانية < br / > ملاحظه: كان لدى بعض الشركات المصنعة التجارية ماسحات ضوئية لا تحافظ على ثبات وقت المكوث لكل بكسل. هذا الثبات أمر بالغ الأهمية لعمل الطريقة.
   8. اضبط حجم البكسل على ~ 120 نانومتر.
   9. حدد وضع اكتساب xyt وحدد عدد الإطارات التي سيتم الحصول عليها لكل عملية استحواذ وبئر (على سبيل المثال 5,000).
   10. إذا كان النظام مزودا بوضع إنتاجية عالية ، فأدخل إحداثيات كل بئر وعدد عمليات الاستحواذ لكل بئر لأتمتة العملية.
       ملاحظه: احرص على التأكد من وجود موزع مياه إذا كنت تستخدم هدف الغمر.
   11. إذا كان النظام مزودا بنظام التروية ، فقم بتحميل محلول BB وبرمجة التروية لتبدأ مباشرة بعد الإطار 5000 لتقييم حركية التثمير أثناء الحصول على 10,000 صورة على سبيل المثال.
3. أضف قطرة من الزيت إلى هدف الغمر بالزيت / الماء إذا كنت تستخدم هدف الغمر في الماء لتصحيح الياقات المصممة ل FCS.
4. قم بتركيب غرفة المراقبة المكونة من 8 آبار على المسرح.
5. حدد البئر الصحيح وركز على الحل.
   ملاحظه: هام: تجنب التركيز بالقرب من الزجاج السفلي لتجنب الانعكاس والتشتت. عند التركيز بشكل أعمق في الحل ، افصل خيار التركيز البؤري التلقائي.
6. ابدأ عملية الاستحواذ واحفظ مجموعة الصور الناتجة بتنسيق TIFF.

4. تحليل الاتجاه والسطوع باستخدام R Package nandb

1. كفحص لجودة المعالجة المسبقة ، استخدم ImageJ لإلقاء نظرة على الصور واستعادة ملف تعريف الكثافة ، كما هو موضح في الشكل 2 أ. هذا مفيد لتحديد ما إذا كان قد حدث الكثير من التبييض الضوئي أم لا. إذا كان هناك الكثير من التبييض ، فإن البيانات ليست مناسبة لمزيد من التحليل.
   ملاحظه: يمكن أن يكون ImageJ مفيدا أيضا لتحويل الصور إلى TIFF من التنسيقات التجارية. يمكن لبرنامج nandb الموضح أدناه العمل فقط مع ملفات TIFF.
2. قم بتنزيل وتثبيت R و RStudio. من الأفضل تنزيل R وتثبيته أولا ، ثم RStudio.
   ملاحظه: فيما يلي وصف لكيفية استخدام حزمة nandb R. معرفة لغة R ليست مطلوبة لاستخدام nandb ، ومع ذلك ، فإنها ستجعل الحياة أسهل.
3. قم بتثبيت حزمة nandb.
   1. افتح RStudio وفي وحدة التحكم ، اكتب install.packages("nandb") وانتظر التثبيت.
4. تعرف على nandb
   1. راجع الدليل.
   2. راجع تعليمات RStudio المضمنة للوظائف المختلفة. ستكون الوظيفة الأكثر احتمالا التي سيتم استخدامها هي السطوع (). عرض ملف التعليمات لهذه الوظيفة عن طريق كتابة ? brightness() في وحدة التحكم.
5. حساب السطوع
   1. لنفترض أن المرء لديه ملف صورة على سطح المكتب يسمى img001.tif (لاحظ أن "nandb" يعمل فقط مع ملفات TIFF). يمكن للمرء أن يحسب سطوع تلك الصورة:
      ب <- السطوع ("~ / سطح المكتب / img001.tif" ، تاو = "تلقائي")
      1. يؤدي هذا إلى تعيين سطوع الصورة إلى المتغير b في R. يضمن tau = "auto" إلغاء اتجاه الصورة بشكل صحيح قبل حساب السطوع. الشيء الأكثر شيوعا الذي يجب القيام به من هنا هو حساب متوسط أو متوسط سطوع الصورة. يمكن للمرء أن يفعل ذلك عن طريق كتابة المتوسط (ب) أو الوسيط (ب). يمكن للمرء أيضا كتابة صورة السطوع على سطح المكتب باستخدام
         ijtiff::write_tif(b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. لنفترض أن المرء لديه مجلد مليء بالصور images_folder على سطح المكتب ويحتاج المرء إلى حساب سطوع هذه الصور وكتابة صور السطوع كملفات TIFF. ثم انظر ؟brightness_folder(). تعالج هذه الوظيفة مجلدا كاملا مرة واحدة:
      brightness_folder("~/Desktop/images_folder", tau = "تلقائي")
      هذا جيد بشكل خاص لأولئك الذين لديهم برامج يفضلونها على R لأن جميع الملفات تتم معالجتها في أمر واحد ، وبعد ذلك يمكن للمرء الاستمرار في العمل مع صور TIFF ذات سطوع الإخراج في البرنامج الذي يختاره ، سواء كان ImageJ أو Python أو أي شيء آخر.

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تطبيق N & B للكشف عن تحولات البروتين المونومر في المحلول. (أ) مسار بصري مبسط لمجهر المسح بالليزر (LSM) المجهز بمصدر ليزر (تم ضبطه على 514 نانومتر في حالة البروتينات المسماة mVenus) موجه (أسهم زرقاء) نحو هدف الغمر (في حالتنا زيت 63X1.4NA) يضيء محلول 100 نانومتر من محلول FKBP12F36V mVenus. يمر مضان الانبعاث (الأسهم الخضراء) عبر مرآة ثنائية اللون ويتم توجيهه نحو مرشح ممر النطاق الذي ينظف ضوء الانبعاث ، وثقب تم تعيينه في وحدة 1 Airy تقع مباشرة أمام كاشف رقمي نقطي قادر على عد الفوتونات. (ب) يتم مسح حجم الإضاءة متحد البؤر ضوئيا من خلال 16 × 16 بكسل لإضاءة جزيئات مفردة FKBP12F36V mVenus تدخل وتخرج من الحجم متحد البؤر للشكل الغوسي مما ينتج عنه مجموعة من تقلبات شدة التألق. (ج) سلسلة الصور المكتسبة بمرور الوقت

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2. هناك حاجة إلى إزالة الاتجاه التلقائي لقياس مجموعة المونومرات في المحلول بدقة. (أ) تم الحصول على مجموعة من 5000 صورة بدقة 16 × 16 بكسل كما هو موضح في قسم البروتوكول. يتم عرض شدة الإطار الأول جنبا إلى جنب مع متوسط ملف تعريف الشدة الذي تم حله بمرور الوقت ، والذي يظهر تقلبات طويلة المدى قد تكون مرتبطة بالتبييض والتأثيرات الأخرى للمذيبات و / أو الفيزيائية الضوئية. مهما كان سبب هذه التقلبات طويلة المدى ، فإنها تؤثر على حسابات السطوع وبالتالي تتطلب تغيير الاتجاه. بدون انحراف الاتجاه التلقائي ، يحصل المرء على B = 1.026 ، بينما بعد الانحراف التلقائي ، B = 1.005. أيضا ، يظهر السطوع بدون (اللوحات اليسرى ، الصف الثاني) ومع (اللوحات اليمنى ، الصف الثاني) تصفية سلسة. (ب) تم تغيير اتجاه نفس البيانات المعروضة في (أ) وأظهرت النتائج من حيث الشدة والسطوع.