Method Article

الفحص المجهري للتوطين المنشط ضوئي ثنائي الجزيئات المضان المقترن

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Nickerson، A. et al.، الفحص المجهري للتوطين المنشط ضوئيا مع تكميل التألق ثنائي الجزيئات (BiFC-PALM). J. Vis. Exp. (2015)

يصف هذا الفيديو BiFC-PALM - مزيج من الفحص المجهري للتوطين المنشط ضوئيا واستكمال التألق ثنائي الجزيئات - لتقييم تفاعلات البروتين والبروتين. يتضمن BiFC اندماج جزأين من البروتين الفلوري مع اثنين من البروتينات المتفاعلة ذات الأهمية. عندما يتفاعل البروتينان ، يتم إحضار الشظايا على مقربة ، مما يسمح للجزأين بالالتقاء معا وإعادة تكوين بروتين فلوري وظيفي. يتم توطين تألق فلوروفور واحد على مستوى جزيء واحد داخل الخلايا بواسطة PALM.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. الاستنساخ

  1. حدد التكوينات المراد استنساخها واختر رابطا. ضع علامة على البروتينات مع الشظايا الموجودة على الطرف N أو C كما هو موضح أدناه حتى لا تعطل توطينها الصحيح. استخدم رابط مرن مثل (GGGGS) x2.
  2. ضع علامة وراثية على البروتينات التي تهم شظايا PAmCherry1. كخيار واحد ، استخدم بلازميدات الاستنساخ المدرجة في قائمة المواد التي تحتوي على شظايا RN (بقايا PAmCherry1 1-159) و RC (Met plus PAmCherry1 بقايا 160-236) مع تسلسلات MCS المحيطة.
    1. خطي البلازميدات التي تحتوي على شظايا RN و RC مع PCR العكسي (أو ملخص التقييد) عند نقطة الإدخال. يتم سرد بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الجدول 1. فيما يلي مثال على بروتوكول PCR المستخدم في مختبر المؤلف (انظر قائمة المواد للحصول على المواد الدقيقة المستخدمة في هذا البروتوكول).
      1. امزج تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل معا ، ليصل إلى حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر مع الماء: إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل رقيق الجدران ، أضف الماء ، 25 ميكرولتر من 2x مزيج رئيسي ، 0.5 ميكرولتر لكل من البادئات الأمامية والخلفية (20 ميكرومتر مخزون مخفف ، تركيز نهائي 0.2 ميكرومتر) ، و 1 نانوغرام من القالب. استخدم ظروف التدوير التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 30 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 7 ثوان و 68 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، وتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. تفاعل البوليميراز المتسلسل الجينات ذات الأهمية لإدخالها في البلازميدات الخطية التي تحتوي على شظايا RN و RC. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل كما في الخطوة 1.2.1 مع وقت التمديد عند 68 درجة مئوية. استخدم بادئات ذات نتوءات تحتوي على تسلسل رابط مرن ، مثل GGAGGTGGTGGTGGAGGTGGAAGT ل (GGGGS) x2 ، و 15 تماثلا زوجا أساسيا لنهايات بلازميدات RN و RC الخطية لإعادة التركيب.
      ملاحظه: يتم عرض الأجزاء المتدلية الأولية للبروتينات ذات الأهمية في الجدول 2 إذا كنت تستخدم البادئات في الجدول 1 لخطية العمود الفقري البلازميد.
    3. استيعاب تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام Dpn1 للتخلص من قالب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أضف 0.5 ميكرولتر من Dpn1 (20 وحدة / ميكرولتر) مباشرة إلى 50 ميكرولتر من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة وتعطيل الحرارة عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إذا استمر قالب الخلفية في الخطوات اللاحقة ، فقم بزيادة كمية الإنزيم أو إطالة وقت الهضم.
      4. قم
    4. بتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عبر عمود الدوران كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
    5. قم بإجراء تفاعل مستقل عن الربط لدمج البلازميد الخطي الذي يحتوي على جزء RN أو RC مع الجين المعني. قم بقياس تركيز منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى: اجمع بين 50 نانوغرام من البلازميد الخطي و 50 نانوغرام من الجين المعني مع 1 ميكرولتر من خلطة الإنزيم الجاهزة واجعل الحجم الإجمالي يصل إلى 5 ميكرولتر مع الماء منزوع الأيونات. احتضن عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ضعه على الثلج ، وأضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE.
    6. تحويل البلازميدات المؤتلفة إلى بكتيريا مختصة.
    7. حدد 2-4+ (حسب الرغبة) مستعمرات لثقافة O / N. أضف 5 مل من مرق LB و 5 ميكرولتر من الكاناميسين (50 مجم / مل من المرقة) في أنبوب دائري القاع سعة 14 مل من مادة البولي بروبيلين ، وأضف مستعمرة البكتيريا المختارة بحلقة تلقيح معقمة. احتضان عند 37 درجة مئوية O / N أثناء الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة.
    8. قم بتجميد 1 مل من ثقافة O / N لمخزون الجلسرين وقم بإعداد الباقي كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
    9. قم بإجراء التسلسل لتحديد استنساخ جيد. إذا كنت تستخدم بلازميدات الاستنساخ في قائمة المواد ، فاستخدم بادئات M13 الأمامية والخلفية (في تفاعلات منفصلة) حسب الضرورة للحصول على التسلسل الكامل لبناء الاندماج. قارن مع التسلسل المتوقع باستخدام أداة محاذاة مثل BLAST من المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) - http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
    10. انقل التركيبات التي تم التحقق منها بالتسلسل إلى بلازميد التعبير عبر تفاعل إعادة التركيب.
      1. أضف 75 نانوغرام من البلازميد الوجهة - مثل PCDNA للتعداء العابرة أو pLenti لتغليف الفيروسات العدسية - و 50 نانوغرام من بلازميد الاستنساخ المؤتلف إلى 1 ميكرولتر من خلطة الإنزيم المسبقة ورفع الحجم الإجمالي إلى 5 ميكرولتر بالماء منزوع الأيونات. احتضن عند 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم أضف 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE.
        ملاحظه: لتغليف الفيروسات العدسية وتوليد خط الخلايا المستقر ، استخدم بلازميد وجهة مختلفة لكل بناء ، على سبيل المثال ، أحدهما مزود بمقاومة البيورومايسين والآخر مع النيومايسين. هذا يسمح باختيار مزدوج للخلايا المنقولة. ضع في اعتبارك أيضا المحفز لكل منها ، مثل محفز الفيروس المضخم للخلايا (CMV) لمستويات التعبير العالية ، أو CMV مع مشغل TetO للتعبير المنظم بالدوكسيسيكلين القابل للضبط.
      2. قم بتحويل 5 ميكرولتر إلى بكتيريا مختصة وقم بتصغير البلازميدات كما في الخطوات من 1.2.6 إلى 1.2.8 ، ولكن باستخدام المضاد الحيوي المناسب (عادة الأمبيسلين).
  3. تحديد التكوين الأمثل ل BiFC.
    1. بلازميدات التعبير المشتركة في خلايا U2OS (أو الخلية المفضلة).
      1. أضف 350 ميكرولتر من DMEM الخالي من الفينول والأحمر والمضاد للمضادات الحيوية المكمل بنسبة 10٪ FBS في كل بئر من شريحة حجرة سفلية زجاجية مكونة من 8 آبار # 1.5. لوحة حوالي 7.5 × 104 خلايا لكل بئر بحيث تكون الخلايا حوالي 70٪ -90٪ ملتقى في اليوم التالي.
      2. في اليوم التالي للطلاء ، قم ببلازميدات التعبير المشترك مع تكوينات مختلفة في كل بئر باستخدام الكاشف المفضل وكما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
        1. لكل بئر ، أضف 125 نانوغرام من كل بلازميد تعبيري إلى 50 ميكرولتر من الوسائط المختزلة الخالية من المصل في أنبوب 0.6 مل والماصة لأعلى ولأسفل للخلط. أضف 1 ميكرولتر من كاشف التعدي أسفل مركز الأنبوب ومباشرة في الوسائط. حرك برفق للخلط واترك التفاعل لمدة 30 دقيقة.
        2. قلل الوسائط في كل بئر من شريحة الغرفة بمقدار النصف تقريبا. يضاف خليط التعدي بالتنقيط إلى الآبار ويرج برفق حتى يمتزج. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24-48 ساعة. قم بتغيير الوسائط في اليوم التالي للتعداد.
    2. صور الخلايا على مجهر مضان كما في البروتوكول 2 بدءا من الخطوة 2.1.4.
      ملاحظه: يمكن تصوير العينة على مجهر مضان قياسي إذا كانت مستويات التعبير عالية وكانت الكاميرا حساسة بدرجة كافية لإخراج الفوتون المنخفض نسبيا ل PAmCherry1. يمكن تنشيط جزيئات PAmCherry1 المعاد تكوينها باستخدام مجموعة مرشح الأشعة فوق البنفسجية (405 نانومتر) قبل التصوير باستخدام مجموعة مرشح الإثارة الخضراء (561 نانومتر).
  4. عند الاقتضاء ، قم بإنشاء تحكم سلبي ، على سبيل المثال ، إدخال طفرة نقطية في أحد البروتينات ذات الأهمية التي تعطل التفاعل. إجراء طفرات موجهة للموقع على بلازميد الاستنساخ للبروتين المراد تحوره والتكوين المختار.
  5. قم بإنشاء خط خلوي مستقر عن طريق تعبئة التركيبات في جزيئات فيروسية وإصابة خلايا U2OS (أو خط الخلية المفضل). ضع في اعتبارك نظام تعبير محفز (التتراسيكلين) بحيث يمكن تحفيز التعبير قبل التصوير إذا كان عدم الرجوع لفترات طويلة من BiFC يمثل مشكلة ، أو إذا كان التعبير القابل للضبط مطلوبا.
    أنذر: يصنف العمل مع الفيروسات على أنه مستوى السلامة البيولوجية 2. في حين أن الأجيال الحديثة من أنظمة التعبئة الفيروسية قد قللت بشكل كبير من احتمالية إنتاج فيروسات مؤهلة للتكاثر ، إلا أن بعض المخاطر لا تزال قائمة. يمكن العثور على المراجع في http://www.cdc.gov/ السلامة البيولوجية / المنشورات /.
    1. كرر الخطوة 1.2.10 باستخدام ناقل وجهة عدسي أو قهقر. قم بزيادة ثقافة O / N إلى 100 مل للحصول على نقاء متوسط ونقاء أكبر للبلازميدات.
    2. في اليوم الأول: ضع حوالي 2 × 106 293T / 17 خلية في طبق مقاس 10 سم لكل بناء ليتم تعبئته.
    3. في اليوم 2: قم بإعداد تفاعل تعداء باستخدام كاشف تعداء من اختيارك وكما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
      1. قم بإعداد خلط مسبق من بلازميدات التعبئة والتغليف بتركيزات نهائية تبلغ 250 نانوغرام / ميكرولتر لتغليف البلازميدات 1 و 2 ، و 100 نانوغرام / ميكرولتر لتغليف البلازميد 3 في ماء معقم. أضف 10 ميكرولتر من خلطة بلازميد التعبئة و 2.5 ميكروغرام من البلازميد المستهدف إلى 1 مل من الوسائط المختزلة الخالية من المصل في أنبوب دائري القاع سعة 5 مل من البولي بروبيلين وماصة لأعلى ولأسفل للخلط. أضف 20 ميكرولتر من كاشف التعدي أسفل مركز الأنبوب ومباشرة في الوسائط.
        1. حرك برفق للخلط واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة حوالي نصف الوسائط من الخلايا وأضف خليط التعداء بطريقة قطرية. يرج برفق للخلط والتحضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. احتضان 10 مل من الوسائط لكل لوحة في أنبوب مع فك الغطاء لدرجة الحرارة وتوازن ثاني أكسيد الكربون
          2. .
    4. في اليوم الثالث: قم بتغيير الوسائط برفق باستخدام الوسائط المحتضنة مسبقا وأعد الخلايا إلى الحاضنة. احتضان أنبوب آخر من الوسائط مع فك الغطاء. ملاحظة: يمكن أن تكون المخلوية ، أو تكوين خلايا كبيرة متعددة النوى ، علامة على أن العبوة تسير على ما يرام. ومع ذلك ، فإن الخلايا في حالة هشة ويمكن فصلها بسهولة. عند تغيير الوسائط، قم بإمالة الماصة بحيث تكون أفقية وأضف الوسائط بالتنقيط إلى حافة واحدة من اللوحة.
    5. في اليوم 4: حصاد الفيروس عن طريق إزالة الوسائط بحقنة والتصفية من خلال مرشح بحجم المسام 0.45 ميكرومتر في أنبوب نظيف سعة 50 مل. استبدل الوسائط برفق بالوسائط المحتضنة مسبقا.
    6. في اليوم الخامس: احصد مرة أخرى كما تم سابقا في الخطوة 1.5.3.3 واجمع المرشح المشترك في نفس الأنبوب سعة 50 مل. أضف 6 مل من مكثف الفيروسات إلى كل أنبوب واخلطه. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل حتى يترسب الفيروس.
      ملاحظه: اعتمادا على صحة الخلايا ، يمكن حصاد الفيروس مرة ثالثة.
    7. تركيز الفيروس عن طريق الطرد المركزي عند 1,500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يمكن استخدام الفيروسات على الفور للعدوى أو تخزينها في 50 ميكرولتر عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد.
    8. ضع حوالي 3 × 105 خلايا U2OS (أو مستهدفة) لكل بئر في صفيحة مكونة من 6 آبار (2 مل من DMEM مع 10٪ FBS لكل بئر) للعدوى ، بحيث تكون الخلايا حوالي 50٪ ملتقية في وقت الإصابة.
    9. في اليوم التالي ، قم بإزالة حوالي نصف الوسائط بحيث يبقى حوالي 1 مل. يصيب 50 ميكرولتر من الفيروس المركز لكل بناء. أضف 1 ميكرولتر من البوليبرين (8 مجم / مل) إلى كل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. قم بتغيير الوسائط في اليوم التالي واحتضانها ليوم آخر قبل اختيار المضادات الحيوية.
      ملاحظه: يمكن أن تختلف كمية الفيروس المراد إضافتها اعتمادا على معدل الإصابة المطلوب. يمكن معايرة الفيروسات باستخدام qRT-PCR.
    10. أضف المضادات الحيوية لتحديد الخلايا المصابة. مطلوب آبار منفصلة بخلايا غير مصابة لم تر الفيروس مثل جزر الكناري لاختبار فعالية الانتقاء. احتضن لمدة 2-7 أيام ، أو حتى يكتمل الاختيار.
      ملاحظه: يجب معايرة التركيزات الفعالة في البداية ، لكنها عادة ما تكون 1.0 ميكروغرام / مل للبورومايسين و 1.0 مجم / مل للنيومايسين.
    11. قم بتوسيع الخلايا إلى طبق أكبر بحجم 10 سم وانتقل إلى البروتوكول 2.
< p class = "jove_title" >2. تصوير الخلايا الثابتة

  1. تحضير عينة للتصوير
    1. قم بتنظيف شريحة حجرة ذات قاع زجاجي مكون من 8 آبار # 1.5 عن طريق إضافة 250 ميكرولتر من 1 متر من هيدروكسيد الصوديوم لمدة ساعة واحدة على الأقل واغسلها جيدا باستخدام PBS.
      ملاحظه: عادة ما تؤدي شرائح الغرفة غير المعالجة إلى إشارة خلفية عالية. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون الخلايا حساسة لهيدروكسيد الصوديوم المتبقي وقد يؤدي الفشل في تنظيف سطح الزجاج تماما (ما يصل إلى 10 مرات غسل) إلى صعوبة التصاق الخلية. إذا لزم الأمر ، قم باحتضان شريحة الغرفة التي تم تنظيفها باستخدام PBS O / N بعد الغسيل. بالنسبة لخطوط الخلايا الحساسة ، قد يساعد الطلاء بكثافة أعلى (على سبيل المثال ، عند التقاء أولي 50٪ -60٪).
    2. لوحة حوالي 5.5 × 104 من خلايا التعبير المستقرة U2OS لكل بئر في 350 ميكرولتر من DMEM الخالي من الفينول الأحمر مع 10٪ FBS بحيث تكون الخلايا سليمة وليست شديدة الالتقاء عند التصوير.
    3. قم بإجراء العلاجات اللازمة للتجربة ، مثل إضافة التتراسيكلين للحث على التعبير عن البروتين.
    4. إصلاح الخلايا مباشرة قبل التصوير.
      1. قبل التثبيت ، قم بإعداد محلول بارافورمالديهايد طازج (PFA) - 3.7٪ PFA في 1x PHEM مع 0.1٪ جلوتارالديهايد (GA). بالنسبة لمحلول PFA سعة 10 مل ، يزن 0.37 جم من PFA وينقل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. أضف 1 مل من الماء المقطر و 30 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم والدوامة. يسخن عند 70 درجة مئوية ودوامة كل 1-2 دقيقة حتى يذوب PFA تماما.
      2. انقل PFA المذاب إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأضف 3.8 مل من الماء المقطر ، و 5 مل 2x PHEM المؤقت ، و 20 ميكرولتر من 25٪ جلوتارالديهايد ، والدوامة للخلط. المخزون ، 2x PHEM المؤقت هو 120 ملي مولار أنابيب ، 50 ملي هيبس ، 20 ملي مولار EGTA ، و 16 ملي مولار MgSO4 ، مع تعديل الأس الهيدروجيني إلى 7.0 مع 10 ملي كيلوست. يمكن تخزين هذا المحلول المثبت عند 4 درجات مئوية لعدة أيام.
        أنذر: PFA و GA كلاهما خطر. قم بإعداد المحلول في غطاء الدخان وارتداء معدات الحماية المناسبة عند التعامل مع كلتا المادتين الكيميائيتين. تجنب الاستنشاق أو ملامسة الجلد مباشرة.
      3. قم بإزالة وسط النمو. اغسل بسرعة باستخدام 500 ميكرولتر من PBS وأضف 250 ميكرولتر من مثبت PFA لكل بئر. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في RT.
    5. قم بإزالة مثبت PFA من العينة وأضف 350 ميكرولتر من PBS أو مخزن التصوير المؤقت (100 ملي تريس مع 30 ملي كلوريد الصوديوم و 20 ملي ملي كلوريد2 ، درجة الحموضة 8.5) لكل بئر.
    6. دوامة 100 نانومتر جزيئات الذهب لتفتيت الركام وإضافة 35 ميكرولتر لكل بئر (10x التخفيف النهائي) لتتبع انجراف المرحلة أثناء التصوير.
  2. الحصول على الصور
    1. قم بتشغيل المجهر. قم بتشغيل ليزر 405 و 561 نانومتر ، ولكن حافظ على المصاريع (الداخلية أو الخارجية) مغلقة في هذه المرحلة. قم بتشغيل كاميرا EMCCD واتركها لتبرد. تأكد من وجود مرشحات 561 نانومتر في مكانها.
    2. افتح برنامج الاستحواذ واضبط وقت التعرض على 100 مللي ثانية وكسب EMCCD على 300 (النطاق 1 - 1,000).
    3. أضف زيت الغمر إلى الهدف وقم بتأمين العينة في مرحلة المجهر.
    4. مع وجود مجال ساطع أو ليزر 561 نانومتر (~ 1 كيلو واط / سم2) ، اجعل العينة في بؤرة التركيز.
    5. لتصوير Ras وبروتينات الغشاء الأخرى ، استخدم هدف TIRF 60X مع فتحة عددية 1.49 وقم بإحضار المجهر إلى تكوين TIRF. اضبط ليزر الإثارة بحيث يكون بعيدا عن المركز عند ضرب الفتحة الخلفية لهدف TIRF ؛ هذا يتسبب في انحراف الليزر عند الوصول إلى العينة. استمر في ضبط الليزر حتى يتم الوصول إلى الزاوية الحرجة وانعكاس الليزر مرة أخرى. ابحث عن خلية لتصويرها مع عرض العديد من جزيئات الذهب. قم بتعيين منطقة اهتمام تحيط بالخلية (أو منطقة داخل الخلية) وجزيئات الذهب.
      ملاحظة: يقلل TIRF من عمق اختراق ليزر الإثارة ويقلل من إشارة الخلفية خارج نطاق التركيز. بالإضافة إلى ذلك ، من المحتمل أن يكون تصحيح الانجراف أكثر دقة عند عرض المزيد من جزيئات الذهب.
    6. إذا كان ذلك متاحا، فقم بتشغيل نظام التركيز البؤري التلقائي لتصحيح انحراف العينة في الاتجاه z. خلاف ذلك ، اضبط التركيز يدويا طوال عملية الاستحواذ إذا خرجت الصورة عن التركيز.
    7. ابدأ الاستحواذ مع إيقاف تشغيل الليزر 405 نانومتر وتشغيل الليزر 561 نانومتر (~ 1 كيلو واط / سم2) في حالة حدوث تنشيط كاف بالفعل (عادة إذا كانت مستويات التعبير عالية). خلاف ذلك ، قم بتشغيل ليزر 405 نانومتر بأقل إعداد لطاقة المصنع (0.02 ميجاوات أو 0.01 واط / سم2) وقم بزيادته تدريجيا (0.1 ميجاوات في المرة الواحدة) حسب الضرورة حتى يكون هناك عدة عشرات من الجزيئات لكل إطار أو بحيث يتم فصل الجزيئات المفردة جيدا.
    8. مع استمرار الحصول على البيانات ، قم بزيادة طاقة الليزر 405 نانومتر تدريجيا للحفاظ على كثافة البقعة ثابتة تقريبا. ملاحظة: عند طاقة الإثارة المنخفضة 405 نانومتر ، يمكن بالفعل تنشيط بعض PAmCherry1. نظرا لأن هذه الجزيئات مبيض ضوئي ، ينخفض عدد جزيئات PAmCherry1 المتبقية القابلة للتنشيط الضوئي ، مما يتطلب تدفقا أعلى للفوتون للحفاظ على نفس كثافة الجزيئات التي تنبعث منها مضان في كل إطار.
    9. استمر في الحصول على الصورة حتى لا تؤدي الطاقة العالية 405 نانومتر (2.5 – 10 واط/سم 2) إلى تنشيط المزيد من أحداث التنشيط.
      ملاحظه: يعتمد إجمالي وقت الاستحواذ على مستوى التعبير وكفاءة التكملة.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. بادئات لخطية بلازميدات الاستنساخ التي تحتوي على شظايا PAmCherry1. يمكن خطية بلازميدات الاستنساخ التي تحتوي على RN و RC باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي عند نقطة الإدخال إما في الطرف N أو C للشظايا. يتم سرد التسلسلات من 5 إلى 3.

تسلسل التمهيدي (5 'إلى 3') استنساخ البلازميد للإدخال عند المحطة N العكسية CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC RN عند N-terminal إلى الأمام GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA RC في N-terminal إلى الأمام GGCGCCCTGAAGGGCGA استنساخ البلازميد لإدخاله عند الطرف C إلى الأمام TAAAAGGGTGGGCGCGCC RN من عكس الطرف C GTCCTCGGGGTACATCCGCTC RC من عكس الطرف C CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG < p class = "jove_content" > الجدول 2. تتدلي لبادئات الجينات ذات الأهمية التي تتطابق مع بادئات الجدول 1.

< p class = "jove_content" >يتم إنشاء 15 زوجا أساسيا من التماثل للتفاعل المستقل عن الربط من الأجزاء المتدلية التمهيدية. بالإضافة إلى ذلك ، تتضمن الأجزاء المتدلية تسلسل الرابط المرن (GGGGS) x2. يمكن إضافة تسلسل الرابط المرن إلى البادئات في الجدول 1 بدلا من ذلك. يتم سرد التسلسلات من 5 إلى 3.

الأجزاء المتدلية للجين ذي الاهتمام بادئات (5 إلى 3) إدخال N-terminal RN أو RC إلى الأمام GAGCTCGGTACCATG عكس RN للإدراج الطرفي N ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCCTCGCCTCTCGCTGCTCAC عكس الإدراج الطرفي N ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC إدراج C-terminal RN إلى الأمام ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGGAAGT إدراج C- المحطة الطرفية RC إلى الأمام GACGAGCTGTACAAGGGGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGGAAGT عكس إدخال المحطة C RN أو RC GCGCCCACCCTTTTA

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments إطار مجهر نيكون تي يو هدف TIRF الغمر بالزيت 60X مع 1.49 NA نيكون CFI Apo TIRF 60x H كاميرا EMCCD أندور اكسون الترا 897 ليزر 561 نانومتر محرك Opto إم جي إل - ج.ن-561 ليزر 405 نانومتر متماسك CUBE-405 50 ميجا واط 561 نانومتر مرآة ثنائية اللون سيمروك Di01-R405 / 488/561 / 635-25x36 مرشح 561 نانومتر سيمروك FF01-525 / 45-25 مرشح الشق 405/561 نانومتر سيمروك NF01-405 / 488 / 568-25 درجة الحرارة ومرحلة التحكم في ثاني أكسيد الكربون توكاي هيت INUBG2ATW بلام PENTR-D-TOPO PAmCherry1_1-159-MCS أدجين 60545 ENTR-D-TOPO إم شيري 160-236-MCS أدجين 60546 pcDNA3.2-DEST تقنيات الحياة 12489-019 pLenti-DEST أدجين http://www.addgene.org/ Phusion عالية الدقة DNA polymerase الترمو: العلمية إف -531 استنساخ In-Fusion HD كلونتك 639649 LR كلوناز تقنيات الحياة هاتف: 11791 تغليف Vira Power Lentivirus تقنيات الحياة K497500 كاشف تعداء X-tremeGENE روش 13873800 Lab-Tek II غطاء زجاجي بغرفة الترمو: العلمية 155409 # 1.5 أطباق القاع الزجاجي خلايا U2OS ATCC إتش تي بي-96 293T / 17 خلية ATCC رقم التعريف الهاتفي-11268 DMEM مع الفينول الأحمر تقنيات الحياة 11995 DMEM لا فينول أحمر تقنيات الحياة هاتف 21063 مصل الأبقار الجنينية تقنيات الحياة 10082 L-15 من Leibovit ، بدون فينول أحمر تقنيات الحياة هاتف: 21083-027 وسط مصل مخفض تقنيات الحياة 31985 محلول ملحي مخزن بالفوسفات تقنيات الحياة 14040 حقنة BD Biosciences 309604 مرشح الحقنة ميليبور SLHV033RB مكثف العدسات الفيروسية كلونتك 631231 مكثف الفيروسات القهقرية كلونتك 631455 طبق ثقافة 10 سم BD Biosciences 353003 6 بئر لوحة ثقافة BD Biosciences 353046 بوليبرين BD Biosciences 353046 بوروميسين تقنيات الحياة أ11138 جي 418 كالبيوكيم 345812 نيومايسين دوكسيسيلين صياد ص2653 قاعدة تريس صياد ص152 EDTA سيغما EDS هيدروكسيد الصوديوم سيغما س 5881 بارافورمالدهيد سيغما 158127 الجلوتارالديهايد سيغما جي 6257 أنابيب سيغما ص 6757 هيبس سيغما إتش 4034 EGTA سيغما 3777 [إ] كبريتات المغنيسيوم سيغما م 2643 هيدروكسيد البوتاسيوم سيغما 221473 كلوريد الصوديوم صياد ص358 كلوريد المغنيسيوم صياد م 33 جزيئات الذهب 100 نانومتر حلول BBI م. جي سي 100 مياه من الدرجة الجزيئية تقنيات الحياة 10977 Dpn1 نيو إنجلاند بيولابيس R0176 طقم تنقية PCR كياجين هاتف: 28104 طقم Miniprep كياجين هاتف: 27104 طقم Midiprep ماشيري ناجل 740410 0.6 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة صياد 05-408-120 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة صياد 05-408-137 أنابيب 15 مل صياد 05-539-12 5 مل أنابيب البولي بروبيلين مستديرة القاع BD Biosciences 352063 14 مل أنابيب بولي بروبلين مستديرة القاع BD Biosciences 352059 أنبوب 50 مل BD Biosciences 352070 أنبوب PCR جيني ميت سي -3328-1 SOC متوسط تقنيات الحياة 15544 [م] مرق LB BD Biosciences هاتف: 244610 كبريتات الكاناميسين صياد بي ت 906 الخلايا المختصة تقنيات الحياة سي 4040

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bimolecular Fluorescence ComplementationPhotoactivated Localization MicroscopyProtein Protein InteractionsRas Raf ComplexFluorescent Protein ReconstitutionSingle Molecule LocalizationTIRF MicroscopyEMCCD CameraGold Particle TrackingLaser Activation

Related Articles