مقالة منهجية

الكشف القائم على تباين الخواص الفلورية لتفاعلات البروتين والبروتين

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Gijsbers, A., et al. تباين التألق كأداة لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين. J. Vis. Exp. (2016).

في هذا الفيديو ، نصف تقنية تباين الخواص الفلورية لدراسة التفاعلات بين بروتين متلازمة شواكمان الماسية (SBDS) الموسوم بالفلوروفور وعامل الاستطالة الشبيه بعامل الاستطالة 1 GTPase (EFL1). عند احتضان بروتينات SBDS بتركيزات متزايدة تدريجيا من EFL1 ، لوحظت زيادة مطردة في تباين الخواص ، مما يشير إلى تفاعل ناجح بين البروتينين.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_title" >1. وضع العلامات على SBDS-FlAsH بصبغة الفلورسنت FlAsH 4',5'-Bis(1،3،2 dithioarsolan-2-yl) الفلوريسين

  1. امزج 3 نانومول من بروتين SBDS-FlAsH (تتوافق علامة FlAsH مع شكل التتراسيستين Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys المعدل وراثيا في الطرف C لبروتين SBDS المؤتلف) مع 3 نانومول من صبغة الفلورسين 4',5'-bis (1،3،2 dithioarsolan-2-yl) في حجم 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتباين الخواص (50 ملي مولار Tris-HCl درجة الحموضة 7.5 ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار كلوريدالصوديوم 2 ، 10٪ جلسرين ، 5 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول).
  2. دع التفاعل يستمر لمدة 8 ساعات عند 4 درجات مئوية.
  3. استخدم قانون لامبرت بير لتحديد النسبة المئوية للبروتين المسمى. قم بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر و 508 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي باستخدام كوفيت كوارتز بحجم مناسب. ملاحظه: ضع في اعتبارك معاملات الامتصاص المولية التالية (M-1 cm-1):
    figure-protocol-1 المعادلة 1
  4. احسب تركيز بروتين SBDS-FlAsH المسمى باستخدام المعادلة 2.
    figure-protocol-2 المعادلة 2
  5. احسب تركيز بروتين SBDS الكلي باستخدام المعادلة 3 عن طريق استبدال CSBDS-FlAsH المحسوب من الخطوة السابقة.
    figure-protocol-3 المعادلة 3
  6. احسب النسبة المئوية للبروتين المسمى باستخدام المعادلة 4.
    figure-protocol-4 المعادلة 4
< p class = "jove_title" >2. تجارب تباين الخواص الفلورية

ملاحظة: تم إجراء تجارب تباين الخواص في مقياس الطيف الفلوري المجهز بصندوق أدوات الاستقطاب وتم جمع البيانات باستخدام برنامج تباين الخواص المقدم في برنامج الجهاز. تم ضبط الطول الموجي للإثارة عند 494 نانومتر مع عرض نطاق طيفي يبلغ 8 نانومتر وتم تسجيل الانبعاث باستخدام مرشح تمرير النطاق 530±25 نانومتر. أجريت القياسات عند 25 درجة مئوية في كوفيت سعة 200 ميكرولتر بطول مسار 5 مم.

  1. في كوفيت مضان ، ضع 200 ميكرولتر من 30 نانومتر SBDS-FlAsH في مخزن مؤقت متباين الخواص وقم بمعايرة 2 ميكرولتر من 30 ميكرومتر EFL1. تخلط جيدا وتترك التفاعل لمدة 3 دقائق قبل قياس قيمة تباين الخواص.
  2. كرر الخطوة 2.1 حتى تتم إضافة حجم إجمالي قدره 40 ميكرولتر من EFL1.

3. تحليل البيانات

  1. قم بملاءمة البيانات مع نموذج الربط المناسب باستخدام خوارزمية انحدار المربعات الصغرى غير الخطية. يتم عرض معادلات نماذج الربط الأكثر شيوعا في الجدول 1.
  2. قم بتقييم أفضل نموذج يصف التفاعل بين البروتينات من خلال فحص بقايا الملاءمة. دعم النموذج المختار بتجارب إضافية.
< p class = "jove_content" > الجدول 1. نماذج ربط تفاعل البروتين والبروتين الشائعة والمعادلات الرياضية التي تصفها.

figure-protocol-5

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قاعدة تريس فورميدميد تريس 01 فائقة النقاء صبغ 4',5'-مكرر (1،3،2 dithioarsolan-2- yl) فلوريسين ثيرموفيشر العلمي ال سي 6090 تحتوي هذه المجموعة على الصبغة لتسمية
علامة FlAsH خلية مضان تحليلات هيلما 111-057-40 مقياس الطيف الضوئي تقنيات Agilent G6860AA كاري 60 UV-Vis مقياس الطيف الفلوري أوليس لا ينطبق Olis DM 45 مع صندوق أدوات الاستقطاب 2-ميركابتو إيثانول سيجما ألدريتش M6250-100 مل كلوريد الصوديوم فورميدميد NAC02 كلوريد الصوديوم مغنكلوريد2 شركة ميرك ميليبور 1725711000 كلوريد المغنيسيوم الجلسرين سيجما ألدريتش جي 5516 الجلسرين Tecsiquim, S.A. de C.V. GT1980-6

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FlAsH SBDS EFL1

مقالات ذات صلة