مقالة منهجية

مقايسة تحول الحركة الكهربية للكشف عن مجمعات عامل النسخ - الحمض النووي

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Hsieh ، Y. W. et al. ، بروتوكول محسن لمقايسة تحول الحركة الكهربية باستخدام قليل النوكليوتيدات ذات الصبغة الفلورية بالأشعة تحت الحمراء. J. Vis. Exp. (2016)

في هذا الفيديو ، نوضح مقايسة تحول الحركة الكهربية للكشف عن تفاعلات البروتين والحمض النووي باستخدام مجسات الحمض النووي المسماة بالفلورسنت بالأشعة تحت الحمراء. عندما يرتبط البروتين بمسبار الحمض النووي ، فإنه يشكل مركبا كبيرا يهاجر ببطء ويظهر كشريط متحرك على الجل.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تفاعل الربط والرحلان الكهربائي

  1. تحضير 1 مل من 5x مخزن مؤقت ملزم عن طريق خلط 50 ميكرولتر من 1 M Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 10 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم ؛ 200 ميكرولتر من 1 M KCl ، 5 ميكرولتر من 1 M MgCl2 ، 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 5 ميكرولتر من 1 M DTT ؛ 25 ميكرولتر من 10 مجم / مل BSA ، و 695 ميكرولتر من ddH2O.
    ملاحظه: يمكن اقتباس المخزن المؤقت الملزم 5x وتخزينه عند -20 درجة مئوية. نقطة أخرى يجب مراعاتها هي أن عوامل النسخ المختلفة سيكون لها تعديلات مختلفة على المخزن المؤقت للربط.
  2. قبل إعداد تفاعلات الربط مباشرة ، قم بتشغيل جل بولي أكريلاميد الأصلي بنسبة 5٪ مسبقا في 0.5x TBE + 2.5٪ جلسرين لإزالة جميع آثار بيرسلفات الأمونيوم عند 80 فولت لمدة 30-60 دقيقة ، أو حتى لا يتغير التيار بمرور الوقت.
  3. قم بإعداد تفاعل الربط في الحجم النهائي البالغ 20 ميكرولتر.
    1. امزج 4 ميكرولتر من 5x مخزن مؤقت ملزم ، 80-200 نانوغرام من البروتين المنقى A (في 50٪ جلسرين ، أي SOX-2) ، 1 ميكرولتر من 0.1 ميكرومتر مسبار مترافق بالصبغة (التركيز النهائي: 5 نانومتر) ، و ddH2O.
    2. اختياري: عندما يكون منافسو المسبار البارد مطلوبين ، أضف تركيزات مختلفة (2x ، 10x ، 25x ، 50x ، 100x ، إلخ) من المجسات الباردة.
    3. اختياري: عند اختبار التفاعل بين البروتينات A و B (أي SOX-2 و LIM-4) ، أضف 80-200 نانوغرام من البروتين B المنقى (في 50٪ جلسرين ، أي LIM-4).
    4. اختياري: عند استخدام مستحضر المستخلص النووي والتحقق من صحة الارتباط المحدد للبروتين A ، أضف جسما مضادا خاصا بالبروتين A (على سبيل المثال ، anti-6xHis ، anti-FLAG ، إلخ).
    5. احتضن في R / T في الظلام لمدة 15 دقيقة.
  4. قم بتحميل جميع تفاعلات الربط على الجل وقم بتشغيل الجل عند 10 فولت / سم إلى المسافة المطلوبة.
< p class = "jove_title" >2. التصوير

ملاحظة: تم مسح الجل مباشرة في الألواح الزجاجية باستخدام نظام تصوير متقدم بالأشعة تحت الحمراء. لذلك ، يمكن حل الجل بشكل أكبر ومسحه ضوئيا بشكل متكرر (الشكلان 1C و 2). كما تم اختبار نظام تصوير الفلورسنت القريب من الأشعة تحت الحمراء في المقام الأول للبقع الغربية لمسح الجل ، ولكن فقط نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء المتقدم كان قادرا على مسح الجل بدقة جيدة. المنهجية الموصوفة خاصة ببرنامج تصوير بالأشعة تحت الحمراء معين ، على الرغم من أنه يمكن استخدام حزم برامج أخرى.

  1. نظف سرير الماسح الضوئي باستخدام ddH2O وجففه جيدا قبل المسح. امسح الألواح الزجاجية للجل وجفف وضع الألواح التي تحتوي على الجل على سرير الماسحة الضوئية.
  2. افتح برنامج التصوير بالأشعة تحت الحمراء وانتقل إلى علامة التبويب "اكتساب". عند وضع اللوحة الأقل سمكا (1 مم) على سرير الماسحة الضوئية، استخدم إعدادات القناة: 700، الكثافة: تلقائي، الدقة: 169 ميكرومتر، الجودة: متوسطة، وإزاحة التركيز البؤري: 1.5 مم. عند وضع اللوحة السميكة (3 مم) على سرير الماسحة الضوئية، استخدم إعدادات القناة: 700، الكثافة: تلقائي، الدقة: 84 ميكرومتر، الجودة: متوسطة، وإزاحة التركيز البؤري: 3.5 مم. يعتمد إزاحة التركيز على سمك اللوحة الزجاجية.
  3. حدد المنطقة التي يشغلها الجل على الماسحة الضوئية. انقر فوق "ابدأ" لبدء الفحص.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1. fEMSA باستخدام قليل النوكليوتيدات ذات الصبغة الفلورية بالأشعة تحت الحمراء. (أ) مخطط انسيابي fEMSA. (ب) تأثير صبغة البروموفينول الزرقاء والبرتقال G و dI-dC (1 ميكروغرام) على fEMSA. تم استخدام 5 نانومتر من مسبار 5'Dye-LIM-4 / SOX-2. (C) fEMSA يظهر خصوصية ربط 6xHis-SOX-2G73E بالموقع المستهدف SOX-2 لعنصر LIM-4 / SOX-2. تم استخدام 5 نانومتر من مسبار 5'Dye-LI...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 30٪ محلول أكريلاميد / مكرر ، 37.5: 1 بيو راد 1610158 مادة الأكريلاميد ضارة وسامة. مصل الأبقار الألبومين الجزيئي علم الأحياء الصف نيو إنجلاند بيولابيس B9000S 5'IRDye700 علامة الحمض النووي أوليغوس تقنيات الحمض النووي المتكاملة قلة الحمض النووي المخصصة يشار إليها باسم oligos DNA ذات الصبغة الفلورية ذات العلامات 5 أو الأشعة تحت الحمراء في المخطوطة. ستقوم الشركة بتصنيع 5 'قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي المسمى IRDye. يتطلب الحد الأدنى من التوليف على نطاق 100 ميكرومتر وتنقية HPLC. خلية الرحلان الكهربائي العمودي Mini-PROTEAN بيو راد 1658000FC جهاز نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء Odyssey CLx LI-COR التكنولوجيا الحيوية نظام Odyssey CLx للأشعة تحت الحمراء Imagng جهاز نظام تصوير Odyssey Fc LI-COR التكنولوجيا الحيوية نظام التصوير ثنائي الوضع Odyssey Fc جهاز برنامج Image Studio (الإصدار 4.0) LI-COR التكنولوجيا الحيوية برنامج Image Studio برمجيات أورانج جي سيجما ألدريتش O3756-25G كيميائي 6x صبغة تحميل برتقالية 0.25٪ برتقال جم ؛ 30٪ جلسرين 0.5x TBE 45 ملي تريس بورات؛ 1 ملي EDTA 1x TE 10 ملي Tris-HCl ؛ 1 ملي EDTA ، درجة الحموضة 8.0 1x STE 100 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 10 ملي Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ؛ 1 ملي EDTA 5x عازلة ملزمة 50 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.5 ؛ 50 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 200 ملي كلوريد الهيدروجين ؛ 5 ملي مللي كلوريد المنظومات 2 ؛ 5 ملي EDTA ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ؛ 5 ملي DTT ؛ 250 ميكروغرام / مل BSA

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA DNA

مقالات ذات صلة