الترسيب المناعي للكروماتين لتحديد مواقع ربط البروتين المستهدف على الحمض النووي الجيني

الملخص

المصدر: Dong، X.، et.al.، تحديد مواقع الارتباط الجينومي لعامل النسخ Olig2 في خلايا PDGFRα + المنقاة بشكل حاد عن طريق تحليل تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين منخفض الخلية.J. Vis. Exp.(2018)

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية الترسيب المناعي للكروماتين لتحديد مواقع ربط البروتين في مناطق معينة من الحمض النووي الجيني لخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن عبر الترسيب المناعي الانتقائي لشظايا الكروماتين المرتبطة بالبروتين. تساعد هذه الطريقة في دراسة تفاعل العديد من البروتينات التنظيمية ، بما في ذلك عوامل النسخ المشاركة في تنظيم الجينات.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تنقية خلايا سلالة الخلايا قليلة التغصن الإيجابية PDGFRα من دماغ الفأر (معدلة من بروتوكولات المناعة الموصوفة سابقا)

1. تحضير صفيحة مناعية لاختيار الخلايا الإيجابية PDGFRα و 2 لوحة لاستنفاد الخلايا البطانية والخلايا الدبقية الصغيرة.< / > ملاحظه: يرجى ملاحظة أن أطباق بتري ولكن ليس أطباق زراعة الخلايا تعمل لتجربة المناعة. إذا تم استخدام الخلايا المنقاة للزراعة ، فيجب تنفيذ خطوات المناعة في خزانة السلامة الحيوية
   1. قم بتغطية صفيحة بتري مقاس 10 سم ب 30 ميكرولتر من الماعز المضاد للفئران IgG في 10 مل من الرقم الهيدروجيني 9.5 ، 50 ملي من Tris-HCl طوال الليل عند 4 درجات مئوية. قم بتحريك اللوحة للتأكد من أن أسطح الألواح مغطاة بشكل متساو وكامل بمحلول الطلاء.
   2. تحضير محلول الأجسام المضادة PDGFRα عن طريق تخفيف 40 ميكرولتر من الجسم المضاد للفئران المضاد ل PDGFRα مع 12 مل من محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات (DPBS) الذي يحتوي على 0.2٪ BSA.
   3. بعد 3 غسلات من الصفيحة المطلية ب IgG مع 10 مل 1x DPBS لكل منها ، قم باحتضان الصفيحة المطلية ب IgG بمحلول الأجسام المضادة PDGFRα في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات.
   4. اغسل الصفيحة المطلية بالأجسام المضادة للفئران المضادة ل PDGFRα 3 مرات مع 10 مل 1x DPBS لكل منهما. أضف محلول DPBS برفق على طول الجدار الجانبي للوحة ولا تزعج الأسطح المطلية.
   5. قم بتغطية 2 من ألواح بتري جديدة مقاس 15 سم لاستنفاد الخلايا البطانية والخلايا الدبقية الصغيرة ب 20 مل من DPBS تحتوي على 2.3 ميكروغرام / مل من Banderiaea simplicifolia lectin 1 (BSL-1) لمدة ساعتين.
   6. اغسل الألواح المطلية BSL-1 3 مرات باستخدام 20 مل 1x DPBS. أضف محلول DPBS برفق على طول الجدار الجانبي للألواح ولا تزعج الأسطح المطلية.
2. يتم تعديل تنقية خلايا سلالة الخلايا قليلة التغصن الإيجابية PDGFRα من الطرق المنشورة سابقا.
   1. قم بتشريح الأنسجة القشرية من أدمغة الفئران في اليوم 7 بعد الولادة (P7) وفقا للبروتوكولات المنشورة مسبقا.
   2. قم بفصل الأنسجة لتوليد معلق أحادي الخلية باستخدام مجموعة تفكك الأنسجة العصبية (P) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة التفصيلية.
   3. باختصار ، قم بتقطيع الأنسجة القشرية المقطعة إلى قطع بمشرط وأخضعها للهضم الأنزيمي عند 37 درجة مئوية. بعد الهضم، قم بفصل القطع يدويا باستخدام ماصات باستور الزجاجية المصقولة بالنار في معلق أحادي الخلية.
   قم
   4. بالطرد المركزي للتعليق أحادي الخلية عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وقم بتعليق حبيبات الخلية باستخدام 15 مل من المخزن المؤقت المناعي (المخزن المؤقت المناعي هو DPBS مع 0.02٪ BSA و 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين).
   5. احتضان معلق الخلية المفردة من 2 دماغة فأر بالتتابع على 2 لوح مطلي ب BSL-1 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف للوحة كل 5 دقائق لضمان استنفاد أفضل للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البطانية.
   قم
   6. بتدوير اللوحة برفق لجمع الخلايا غير الملتصقة في معلق الخلية واحتضانها على الصفيحة المطلية بالأجسام المضادة للفئران-PDGFRα لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   7. بعد حضانة تعليق الخلية على الصفيحة المغلفة بالأجسام المضادة للفئران-PDGFRα ، قم بتدوير اللوحة برفق لتجميع تعليق الخلية ، واشطف اللوحة 8 مرات باستخدام DPBS للتخلص من الخلايا غير الملتصقة. أضف محلول الغسيل برفق على طول الجدار الجانبي للوحة وحرك اللوحة عدة مرات للتخلص من الخلايا غير الملتصقة.
   8. افصل الخلايا عن اللوحة المطلية بالأجسام المضادة للجرذان-PDGFRα باستخدام 4 مل من معالجة محلول انفصال الخلية لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   9. اجمع OPCs المنقاة عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتعليق حبيبات الخلية بوسط زراعة خلايا OPC سعة 2 مل ، وعد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق ومقياس كثافة الدم (500 مل وسط زراعة الخلايا في وسط DMEM / F12 الذي يحتوي على 5 مل من محلول البنسلين والستربتومايسين (P / S) ، 5 مل N2 ، 10 مل B27 ، 5 ميكروغرام / مل أنسولين ، 0.1٪ BSA ، 20 نانوغرام / مل bFGF و 10 نانوغرام / مل PDGFRα).
3. التحقق من نقاء OPCs بعد التمثيل المناعي.
   1. من أجل تقييم تخصيب OPCs بعد المناعة, استخدم بعض OPCs المنقاة لاستخراج الحمض النووي الريبي مع استخراج الجوانيديوم ثيوسيانات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   2. قم بإجراء qRT-PCR باستخدام مزيج الصبغة الخضراء الفلورية الرئيسية للتحقق من إثراء تعبير PDGFRα في OPCs المنقاة مقارنة بخلايا الدماغ المنفصلة وفقا للمواد المنشورة سابقا.
   3. بالإضافة إلى ذلك ، قم بزرع بعض OPCs المنقاة في 24 لوحة بئر مطلية ب Poly-D-Lysine للتلوين المناعي باستخدام الجسم المضاد للبروتيوغليكان كبريتات شوندروتن (NG2) المضاد للمواد المنشورة سابقا.

2. إعداد ChIP منخفض الخلية وبناء مكتبة ChIP لتسلسل عالي الإنتاجية

1. Olig2 إعداد ChIP منخفض الخلية مع نظام صوتنة متاح تجاريا ومجموعة ChIP ذات رقم خلية منخفض متوفرة تجاريا (انظر جدول المواد) باتباع الإجراءات القياسية التفصيلية من تعليمات الشركة المصنعة.
   1. بعد الانفصال عن اللوحة المطلية بالأجسام المضادة للفئران المضادة ل PDGFRα وعد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق ومقياس الدم ، ضع 20,000 OPCs منقاة في وسط ثقافة خلايا OPC سعة 1 مل لكل تفاعل ChIP.
   2. أضف 27 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 36.5٪ لإصلاح تعليق الخلية لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      أنذر: يرجى ملاحظة أنه يجب استخدام الفورمالديهايد في غطاء الدخان الكيميائي لأسباب تتعلق بالسلامة.
   3. أوقف الارتباط المتبادل بين بروتين الحمض النووي مع 50 ميكرولتر 2.5 م جلايسين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظه: يجب تنفيذ جميع الخطوات على الجليد أو في غرفة باردة 4 درجات مئوية من هذه النقطة.
   4. اغسل كريات الخلايا المتشابكة ب 1 مل من محلول الملح المتوازن هانكس المثلج (HBSS) مع كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني واحصل على الخلايا المحببة بواسطة جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية.
   5. قم بتحلل حبيبات الخلية في 25 ميكرولتر كامل من محلول التحلل لمدة 5 دقائق على الثلج.
      ملاحظه: حرك الأنبوب لتعليق الخلايا في Lysis Buffer.
   6. استكمل محللة الخلية مع 75 ميكرولتر HBSS المثلج الذي يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز وقص الكروماتين من محللة الخلية بواسطة نظام صوتنة مبرد مسبقا مع 5 دورات من 30 ثانية ON و 30 ثانية OFF البرنامج. قم دائما بصوتنة 6 أنابيب معا وتأكد من أن أنابيب التوازن تحتوي على 100 ميكرولتر من الماء.
   7. بعد القص ، جهاز الطرد المركزي عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع الطاف في أنبوب جديد بعد الطرد المركزي.
   8. قم بتخفيف 100 ميكرولتر من الكروماتين المنفصم بحجم متساو من ChIP Buffer الكامل المثلج البارد باستخدام مثبط البروتين.
   9. وفر 20 ميكرولتر من الكروماتين المخفف كعينة تحكم في الإدخال.
      ملاحظه: مطلوب أيضا عينة التحكم في المدخلات كمقارنة مع عينة Olig2 المناعية لتحديد الحمض النووي المرسب المناعي للأجسام المضادة Olig2.
   10. أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد للأرانب المضاد للأوليغ2 إلى 180 ميكرولتر من الكروماتين المخفف المنفصم واحتضان أنبوب التفاعل على عجلة دوارة عند 40 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
       ملاحظه: قم بتنفيذ هذه الخطوة في غرفة باردة.
   11. لكل تفاعل ChIP ، اغسل 11 ميكرولتر من الخرز المطلي بالبروتين المغناطيسي A مع 55 ميكرولتر من الخرز ووضع حبيبات الخرزة في 11 ميكرولتر من مخزن غسيل الخرزة بعد غسلتين.
       ملاحظه: قم بتنفيذ هذه الخطوة في غرفة باردة.
   12. لكل تفاعل ChIP ، أضف 10 ميكرولتر من حبات البروتين المطلية بالبروتين A المغسولة مسبقا إلى أنبوب تفاعل ChIP. قم بتنفيذ هذه الخطوة في غرفة باردة.
   13. احتضان أنبوب تفاعل ChIP عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين أخريين على عجلة دوارة.
   14. ضع أنبوب تفاعل ChIP على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة
       ملاحظه: قم بتنفيذ هذه الخطوة في غرفة باردة.
   15. قم بإزالة المادة الطافية ولا تتخلص من حبيبات الخرزة.
   16. اغسل حبيبات الخرزة ب 100 ميكرولتر لكل من مخازن الغسيل الأربعة على التوالي لمدة 4 دقائق على عجلة دوارة عند 4 درجات مئوية.
   17. بعد الغسيل ، أضف 200 ميكرولتر من محلول الشطف إلى حبيبات الخرزة واحتضان أنبوب تفاعل ChIP عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لعكس البروتين المتقاطع.
   18. بالإضافة إلى ذلك ، أضف 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف إلى 20 ميكرولتر من عينة التحكم في الإدخال واحتضانها عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لعكس البروتين المتقاطع-الحمض النووي أيضا.
   19. أضف 200 ميكرولتر 25: 24: 1 (حجم / حجم) خليط من الفينول والكلوروفورم وكحول الأيزواميل إلى كل أنبوب تفاعل ChIP.
   20. دوامة بقوة لمدة 1 دقيقة وجهاز طرد مركزي عند 13,000 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل المرحلة العليا إلى أنبوب جديد.
   21. أضف 40 ميكرولتر 3 م محلول أسيتات الصوديوم ، و 1,000 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ ، و 2 ميكرولتر من ترسيب الجليكوجين المرتبط تساهميا بصبغة زرقاء لكل أنبوب تفاعل ChIP بين عشية وضحاها عند -20 درجة مئوية.
   22. جهاز طرد مركزي عند 13,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   23. تخلص من المادة الطافية ، واغسلها ب 500 ميكرولتر بارد 70٪ إيثانول ، وجهاز طرد مركزي عند 13,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   24. تخلص من المادة الطافية ، وحافظ على الحبيبات جافة في الهواء لمدة 10 دقائق ، وقم بإذابة الحبيبات ب 50 ميكرولتر من الماء.
2. بناء مكتبة ChIP لتسلسل عالي الإنتاجية
   1. قم بتنظيف وتركيز الحمض النووي ل ChIP باستخدام مجموعة تنظيف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   2. حدد عينة ChIP باستخدام pico-green وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   3. استخدم مجموعة ChIP-seq لمخلفات T ، والنسخ المتماثل ، والمخلفات ، وتبديل القوالب وتمديدها ، وإضافة المحولات والتضخيم ، واختيار حجم المكتبة ، والتنقية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      1. بعد تمسخ dsDNA ، قم بإزالة الفوسفورة من نهاية 3 'من ssDNA بواسطة فوسفاتيز قلوي الجمبري وأضف ذيلا بولي (T) إلى ssDNA بواسطة deoxynucleotidyl transferase الطرفي.
      2. تلدين DNA Poly (dA) التمهيدي إلى قالب ssDNA لتكرار الحمض النووي وتبديل القالب.
      3. بعد تبديل القالب ، قم بتضخيم مكتبة ChIP-seq بواسطة PCR باستخدام الاشعال الأمامية والخلفية للفهرسة.
      4. حدد مكتبة ChIP-seq المضخمة PCR مع أجزاء تتراوح من 250 إلى 500 نقطة أساس بواسطة الخرز المغناطيسي حسب الخيار 2 لاختيار الحجم المزدوج.
      5. افحص جودة مكتبة ChIP-seq المختارة باستخدام جهاز الرحلان الكهربائي للرقاقة الشعرية ذات الموائع الدقيقة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كاشف / معدات Banderiaea simplicifolia ليكتين 1 مختبرات ناقلات # L-1100 الفئران المضادة PDGFRa المضادة BD Bioscience # 558774 طقم تفكك الأنسجة العصبية (P) ماك ميلتيني بيوتيك # 130-092-628 أكوتاز تقنيات STEMCELL # 07920 تريزول ثيرمو فيشر # 15596026 الأجسام المضادة للكبريتات شوندروتن المضادة للبروتيوغليكان المضادة ل NG2 ميليبور # AB5320 جهاز صوتنة Bioruptor Pico دياجينود # B01060001 مجموعة MicroChIP الحقيقية دياجينود # C01010130 الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (25: 24: 1 ، الخامس / الحجم) ثيرمو فيشر # 15593031 NucleoSpin Gel و PCR Clean-Up Kit-Up ماشيري ناجل # 740609 مجموعة فحص Quant-iT PicoGreen dsDNA ثيرمو فيشر # ص 11496 مجموعة DNA SMART ChIP-Seq مختبرات Clontech # 634865 Agencourt AMPure XP بيكمان فولتر # أ 63880 جليكو بلو ثيرمو فيشر # AM9516 بيكو جرين ثيرمو فيشر # ص 11496 د-بي بي إس ثيرمو فيشر # 14190-144 SYBR مزيج ماستر جرين مختبرات بيو راد # 1725124 DMEM / F12 فيشر ساينتيك # 11-320-033 البنسلين الستربتومايسين (P / S) فيشر ساينتيك # 15140122 ملحق N-2 فيشر ساينتيك # 17502048 مكمل B-27 فيشر ساينتيك # 17504044 إنسولين سيغما # I6634 تحضير محلول الأنسولين 0.5 مجم / مل عن طريق إذابة 5 ملغ من الأنسولين في 10 مل من الماء و 50 ميكرولتر من 1 نيوتروجين حمض الهيدروكلوريد. ألبومين مصل الأبقار ، مناسب لزراعة الخلايا (BSA) سيغما # أ 4161 قم بإعداد محلول BSA بنسبة 4٪ عن طريق إذابة 4 جم من BSA في 100 مل D-PBS وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 البروتين الأساسي لعامل نمو الخلايا الليفية ، مؤتلف بشري (bFGF) EMD ميليبور # GF003 PDGF-AA البشري VWR # 102061-188 بولي دي ليسين VWR # IC15017510 تحضير محلول 1 مجم / مل بولي دي ليسين عن طريق إذابة 10 مجم بولي دي ليسين في 10 مل من الماء وتخفيفه 100 مرة عند الاستخدام. أطباق فالكون بتري يمكن التخلص منها ، معقمة ، كورنينج ، 100 × 15 ملم VWR # 25373-100 أطباق فالكون بتري يمكن التخلص منها ، معقمة ، كورنينج ، 150x15 ملم VWR # 25373-187 HBSS، 10X، خال من الكالسيوم، خال من المغنيسيوم، خال من الفينول الأحمر فيشر ساينتيك # 14185-052 تريبان بلو تقنيات الخلايا الجذعية # 07050 كوكتيل مثبط البروتياز سيغما # 11697498001 الأسماء التمهيدية المستخدمة ل qPCR تسلسلات التمهيدي المستخدمة في qPCR ميغابت في المبت: CTATAAATCGGCTCACAAGG ميغابت في السبب: AGGCGGTTATATTAAGAAGC Iba1-F: ACTGCCAGCCTAAGACAACC Iba1-R: GCTTTTCCTCCTGCAAATCC Mog-F: GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC Mog-R: TGAATTGTCCTGCATAGCTGC جابد إف ATGACATCAAGAAGGTGGTG جابد دي إتش آر CATACCAGGAAATGAGCTTG Tuj1-F TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG Tuj1-R GATGACCTCCCAGAACTTGGC PDGFRα-F AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC PDGFRα-R GTCCCTCCACGGTACTCCT