تباين الخواص الفلورية لتحديد تقارب ربط عامل النسخ والحمض النووي

الملخص

المصدر: Jung، C. et al. ، قياس الحساسية العالية لتقاربات ارتباط عامل النسخ والحمض النووي عن طريق المعايرة بالتحليل الحجمي التنافسي باستخدام الفحص المجهري الفلوري. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تباين الخواص الفلورية عالي الأداء الذي يساعد على مراقبة التفاعل بين عوامل النسخ والحمض النووي. يراقب الفحص تفاعلات جزيء الحمض النووي المسمى بالفلوروفور مع عامل النسخ المحدد الخاص به عن طريق قياس درجة الاستقطاب بسبب الدوران الجزيئي أو تباين الخواص للحمض النووي المسمى بالفلوروفور.

البروتوكول

فئة

1. الفحص المجهري للاستقطاب

1. لإضاءة الليزر واسعة النطاق ، ركز خط 638 نانومتر من ليزر الصمام الثنائي المستمر (40 ميجاوات) على فتحة الألياف الضوئية متعددة الأوضاع لتنظيف الحزمة. قم بتركيب مستقطب خطي عند إخراج الألياف لضبط استقطاب ضوء الليزر.
2. قم بحظر مكون الإثارة للضوء المنبعث بمرآة ثنائية اللون (قطع 640 نانومتر) ومرشح ممر النطاق (ممر النطاق 700/75).
3. دع إشارة التألق تمر عبر مقسم شعاع مستقطب ، والذي يقسم الضوء المنبعث إلى مكوناته المستقطبة المتعامدة والمتوازية. بعد ذلك ، قم بتركيز الحزمة غير المنعكسة (المكون المتوازي) والحزمة المنعكسة (المكون العمودي) بعدسة لونية بطول بؤري 200 مم على شريحة كاميرا EM-CCD ذات الإضاءة الخلفية (الشكل 1 ب و 1 ج). استخدم مرآة لضبط اتجاه الشعاع العمودي باتجاه العدسة.

< p class = "jove_title" >2. تصميم واختبار قلة الحمض النووي المرجعي المسمى بالفلورسنت

1. تحديد التسلسل الأساسي للحمض النووي المرجعي: تعتمد الطريقة على اختبار تنافسي يقيس ثابت التفكك (K_D2) بين عامل النسخ وقليل الحمض النووي المنافس غير المسمى الذي يتنافس على الارتباط بالحمض النووي المسمى بالفلورسنت والذي يعمل تقاربه مع TF كمرجع (K_D1). يمكن أن يكون تسلسل الإجماع الذي تم الحصول عليه من مصادر أخرى مثل بصمة DNase أو الهجين البكتيري 1 بمثابة نقطة انطلاق.
   ملاحظه: كقاعدة عامة ، فإن الحمض النووي المرجعي المناسب له انخفاض بنسبة 3 إلى 7 أضعاف في تقارب الارتباط ب TF مقارنة بتسلسل الإجماع.
2. قم بالقياس بواسطة HiP-FA K_D1s من 2-3 طفرات مفردة مبدئية لتسلسل الإجماع المستمد في الخطوة السابقة. حاول تغيير المواضع في تسلسلات الإجماع التي ليست محددة للغاية لتجنب الفقدان الكامل للربط.
   ملاحظه: من المهم أن يكون التسلسل المرجعي مرتبطا بعامل النسخ ذي الأهمية (استخدمناه في هذا البروتوكول Giant Gt) ، ولكن ليس بقوة كبيرة ، حتى يتمكن المنافسون الأضعف من التفوق عليه بتركيزات عالية.
3. قم بتمديد الشكل الأساسي (8-12 زوجا أساسيا بشكل عام) إلى طول 16 زوجا أساسيا أو أكثر عن طريق إضافة تسلسل محيط متماثل على كلا الجانبين (أضف سلاسل جانبية للربط المناسب). إذا لزم الأمر (لمجالات الربط الأطول ، على سبيل المثال) ، استخدم تسلسلات أطول (تم اختبار ما يصل إلى ~ 50 زوجا أساسيا في الطول باستخدام مقايسة HiP-FA).
   أنذر: احرص على عدم إضافة قواعد من المتوقع أن تنشئ مواقع ربط خارج الرحم. استخدم الأدوات الحسابية التي تتنبأ بمواقع الربط من PWMs المتاحة لتسهيل هذه العملية (على سبيل المثال ، PySite).
كما هو الحال
4. مع الحمض النووي المرجعي المسمى ، اطلب أوليغومرات التي تم تصنيفها بالفلورسنت على خيط أمامي أو خلفي في نهاية 3 أو 5. استخدم ، على سبيل المثال ، Cy5 أو Bodipy-650 أو أي صبغة أخرى مناسبة بتركيز 10 ميكرومتر (100 ميكرومتر 10x مخزون) في الماء ، وقم بتخفيفه تدريجيا كما هو موضح في الخطوة 3.1.
5. قم بإعداد 500 مل من 1x مخزن مؤقت للربط عن طريق إضافة 33 ملي مولار من فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني = 7.0) و 90 ملي كلوريد الصوديوم و 0.01٪ منظف غير أيوني في الماء المقطر. قم أيضا بإعداد مخزن مؤقت ملزم 3x ، والذي يحتوي على نفس المكونات ، باستثناء تركيزات ثلاثية الأضعاف. في حالة استخدام مخزن مؤقت ملزم 3x كحل مخزون للمخزن المؤقت للربط 1x ، قم بإعداد وحدات تخزين > 500 مل ؛ خلاف ذلك ، قم بإعداد 250 مل
   ملاحظه: تم تحسين هذه التركيبة لاستقرار عامل النسخ ولمنع إضعاف الجلوتاثيون S-transferase (GST).
6. قم بالقياس باستخدام إعداد الفحص المجهري الموصوف في الخطوة 1 ، FA البالغ 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم الذي يحتوي على 0.8 نانومتر من الحمض النووي المرجعي المسمى في وجود كميات مختلفة من TF في صفيحة مجهرية ذات قاع زجاجي 96 بئرا (5-6 آبار بتركيزات TF مختلفة) لتحديد تركيز TF المراد استخدامه. قم بإجراء سلسلة معايرة بكميات متزايدة من TF واختر للفحص التركيز الذي يصل منحنى من أجله إلى هضبة ، مما يشير إلى الارتباط الكامل لقلة مرجع الحمض النووي.
   ملاحظه: يعتمد تركيز TF الأمثل على قيم ثوابت تفكك TF-DNA. بشكل عام ، تتطلب_KDsالمنخفضة تركيزات أقل.

< ص الفئة = "jove_title" >3. أوليغومر التلدين

1. لتلدين أوليغومرات الحمض النووي للحمض النووي المرجعي المسمى (التسلسل المحدد في الخطوة السابقة) ، امزج 7 ميكرولتر من محلول DNA أحادي الشريطة ذو صبغة 10 ملي مولار و 7 ميكرولتر من تركيز 10 ملي مولار من مكملته العكسية غير المسمى في 186 ميكرولتر من الماء.
2. بالنسبة لتسلسلات الحمض النووي للمنافسين ، امزج 20 ميكرولتر من محاليل 100 ملي مولار (في الماء ، مقدمة من الشركة المصنعة) من الحمض النووي أحادي الشريطة الأمامي مع 20 ميكرولتر من 100 ملي مولار من الحمض النووي العكسي أحادي الشريطة المقابل لكل تسلسل منافس فردي ليتم قياسه.
3. قم بإجراء التلدين بشكل منفصل في جهاز تدوير PCR قياسي عن طريق تسخين المحاليل إلى 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق وخفض درجة الحرارة إلى RT بمعدل 0.1 K / s. إذا كان جهاز PCR المستخدم لا يدعم تدرجات درجة الحرارة بهذا المعدل ، فما عليك سوى إجراء حضانات تدريجية مع انخفاض درجات الحرارة (تم اختبارها 99 دورة من 3 ثوان مع -0.4 كلفن لكل دورة).

< ص الفئة = "jove_title" >4. تحضير الجل

ملاحظة: يشرح القسم التالي تحضير نوعين مختلفين من المواد الهلامية: 1) تحتوي آبار المعايرة على مواد هلامية تحتوي على بروتين وتستخدم لتحديد_KDsلتسلسل الحمض النووي المنافس المعني ، و 2) تستخدم آبار المعايرة NB لتحديد تركيز الحمض النووي في كل نقطة زمنية معينة وارتفاع الاستحواذ. ينصب التركيز على إعداد التجربة في صفيحة مكونة من 96 بئرا ، ولكن يشار أيضا إلى الأحجام المقابلة لتنسيق لوحة 384 بئرا.

1. قم بإذابة 0.5٪ وزن / حجم من نقطة انصهار منخفضة من الاغاروز في المخزن المؤقت الملزم عن طريق غليه في فرن ميكروويف مختبر. بعد الذوبان الكامل ، اضبط مستوى الصوت مرة أخرى باستخدام ddH₂O للتعويض عن التبخر المحتمل.
   ملاحظه: للراحة ، قم بإعداد مخزون من 10-20 10 مل من المواد الهلامية وقم بإذابتها عند 75 درجة مئوية عند الحاجة. يمكن تخزين مخزون الجل في RT.
   أنذر: احرص على تجنب ارتفاع درجة حرارة محلول الجل في فرن الميكروويف. يفضل استخدام فترات زمنية قصيرة مع الاهتزاز بينهما.
2. لتحضير آبار المعايرة بالتحليل الحجمي والمعايرة، قم أولا بإذابة حصتين من مخزون الهلام سعة 10 مل عند 75 درجة مئوية تحت الاهتزاز.
   1. استخدم 240 ميكرولتر (بما في ذلك 20٪ من النفقات العامة) لكل منافس (ن = عدد تسلسلات المنافسين).
   2. استخدم نفس حجم الجل لمعايرة NB جيدا لضمان درجة حرارة ولزوجة متساوية لكلا المواد الهلامية.
   3. ثم اضبط درجة الحرارة على 35 درجة مئوية وانتظر حتى تتوازن درجة الحرارة.
3. بالنسبة لآبار المعايرة بالتحليل الحجمي، أضف 1.4 نانومتر (التركيز النهائي) الحمض النووي المرجعي المهجن (الذي تم الحصول عليه في الخطوة 3)، وبروتين TF (التركيز النهائي CTF = 20-60 نانومتر، كما هو محدد في الخطوة 2.6)، وDTT (0.2 ملم)، ومخزن مؤقت ملزم بحجم إجمالي يساوي n × 200 ميكرولتر أو n × 13 ميكرولتر في شكل لوحة 96 أو 384 بئرا، على التوالي (بالإضافة إلى النفقات العامة). تخلط جيدا عن طريق قلب / رج (لا تقم بالدوامة).
4. أضف ببطء 200 ميكرولتر لكل بئر في شكل صفيحة 96 بئرا (13 ميكرولتر/بئر ل 386 بئرا) من محلول الهلام المحضر في الخطوة السابقة في آبار المعايرة بالتحليل الحجمي في صفيحة البئر.
5. بالنسبة لآبار المعايرة ، أولا ، أضف 5 نانومتر NB إلى الجل المذاب خارج الآبار (الحجم الإجمالي يعتمد على تنسيق لوحة البئر المستخدمة وعدد آبار المعايرة ؛ عادة ما يكون 5-6 لكل لوحة بئر كافية).
6. ماصة 200 ميكرولتر (13 ميكرولتر لشكل لوحة 384 بئر) من الجل المحتوي على NB ببطء داخل آبار المعايرة بالتحليل الحجمي للوحة البئر وتأكد من تجنب فقاعات الهواء.
   ملاحظه: يزيد استخدام الماصات الإلكترونية أو الروبوتات بشكل كبير من قابلية التكاثر.
7. دع الجل يتجمد لمدة 10 دقائق عند RT ، و 10 دقائق أخرى عند 4 درجات مئوية (قم بإزالة التكثيف من الزجاج بعد ذلك إذا لزم الأمر). تأكد من إجراء كل هذه الخطوات على سطح أفقي تماما لتجنب أسطح الهلام غير المتجانسة.
   ملاحظه: عادة ما تكون المواد الهلامية المحتوية على البروتين مستقرة لعدة ساعات على الأقل عند 4 درجات مئوية.

5. إضافة حل الحمض النووي للمنافس

ملاحظة: يجب تحضير المحاليل التالية قبل بدء المعايرة بالتحليل الحجمي وإضافتها فوق آبار المعايرة والمعايرة بالتحليل الحجمي في وقت واحد.

1. أضف الحمض النووي المرجعي المسمى الملدن والبروتين في مخزن مؤقت ملزم 3x بتركيزات أعلى 3 مرات من حصص مخزون الهلام.
   1. امزج 20 ميكرولتر من المحلول الذي تم الحصول عليه مع 40 ميكرولتر من كل محلول DNA منافس صلب تم الحصول عليه في الخطوة 3.
   2. لكل بئر معايرة ، امزج 20 ميكرولتر من مخزن مؤقت ربط 3x يحتوي على محلول NB 15 ملي مولار مع 40 ميكرولتر من الحمض النووي المنافس الملدن (أي تسلسل من نفس الطول مناسب).
      ملاحظه: بالنسبة للألواح المكونة من 384 بئرا ، استخدم 21 ميكرولتر بدلا من 60 ميكرولتر في المجموع.
2. اختياريا ، تحقق من تجانس مستويات ارتفاع الهلام في الآبار المختلفة للوحة طيفيا عن طريق قياس الامتصاص عند 380 نانومتر ، باستخدام قارئ لوحة متعدد الآبار (تتناسب قيم الامتصاص مع ارتفاعات الهلام).
3. أضف 50 ميكرولتر (7 ميكرولتر لتنسيق لوحة 384 بئرا) من محاليل الحمض النووي المنافس المختلطة (الملدنة في الخطوة 3) أعلى المواد الهلامية. حاول إضافة جميع الحلول المنافسة في وقت واحد قدر الإمكان باستخدام ماصات إلكترونية متعددة القنوات أو رأس سحب العينات من 96 قناة، إن وجدت. بعد إضافة الحلول المنافسة ، ضع اللوحة على مرحلة المجهر وابدأ القياسات على الفور.

6. الحصول على الصور

1. اكتساب سلسلة زمنية متتابعة من مكدسات z (على سبيل المثال ، استخدم 12 طائرة و 100-300 مللي ثانية من وقت الإضاءة). تجنب التقاط الصور بالقرب من سطح البئر (< ~ 1.4 ميكرومتر مع الألواح المستخدمة هنا) لاستبعاد أي تحيز للاستقطاب.
2. قم بإجراء 10-25 دورة من القياسات حتى يتم فك الارتباط الكامل للحمض النووي المرجعي المسمى من TF. عادة ما يتم الوصول إلى نقطة النهاية بعد 1-2 ساعة ، اعتمادا على حركية الربط وانتشار الحمض النووي للمنافس.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تصوير تخطيطي لمقايسة HIP-FA والإعداد التجريبي. (أ) نظام توصيل الجل لمعايرة الحمض النووي للمنافس في الآبار المفردة. (ب) إعداد الفحص المجهري HIP-FA. مجهر آلي واسع النطاق مخصص مع كشف الضوء الفلوري المستقطب على كاميرا EM-CCD. (ج) صورة مضان خام مع منطقتي الاهتمام المستخدمة لتحديد المكونات المستقطبة المتوازية (الحمراء) والعمودية (الخضراء). (د) التصميم النموذجي للوحة مكونة من 96 بئرا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قلات الحمض النووي Cy5-labled 16- / 18 نقطة أساس يوروفينز توليف مخصص 16- / 18-bp قلة الحمض النووي يوروفينز توليف مخصص النيل الأزرق أ سيغما N5632-25G Sensoplate plus microplate 96- أو 384-well ، PS غرينر 655891 384-حسي حسي ، أسود غرينر 788896 الاغاروز ، درجة حرارة التبلور المنخفضة سيغما A9414-50G كلوريد الصوديوم ميرك 1.06404.1000 توين 20 سيغما P1379-1L ثنائي فوسفات الهيدروجين ثلاثي هيدرات البوتاسيوم ميرك 1.05099.1000 فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم ميرك 1.04873.1000 عنصر Q-POD ميرك ميليبور ZMQSP0DE1 ميليباك 40 فلتر جاما جولد ميرك ميليبور MPGL04GK2 نظام تنقية المياه Milli-Q Integral 3 ميرك ميليبور ZRXQ003WW كوانتوم تكس ميرك ميليبور QTUMOTIX1 دي إل ديثيوثريتول سيغما 43815-1 جرام Mastercycler التدرج إيبندورف Z316083 أنبوب SafeSeal 1.5 مل سارستيدت 72.706.200 أنبوب 15 مل سارستيدت 62.554.502 كوب Multiply-Pro 0.2 مل PP سارستيدت 72.737.002 إعداد الفحص المجهري: مجهر واسع النطاق آلي لايكا DMI6000 هدف المسافات الطويلة لايكا HCX PL FLUOAR L 60x / 0.60 NA جاف 638 نانومتر خط ليزر مستمر أوميكرون PHOxX 638-40 ، 40 ميجا واط كاميرا EM-CCD بإضاءة خلفية أندور اكسون DV897 مرآة ثنائية اللون AHF قطع 640 نانومتر مرشح ممر النطاق الترددي AHF ممر نطاق ET 700/75 المستقطب الخطي ثورلاب LPVISC050 - MP2 مقسم شعاع الاستقطاب ثورلاب بكالوريوس 010 عدسة لونية ثورلاب البعد البؤري 200 مم الألياف الضوئية متعددة الأوضاع أوبترونيس FVP600660710 النظام الروبوتي: يشتمل نظامنا الآلي على محطة عمل Biomek NXP برأس 96 قناة وماصات Span-8 ، متصلة بمكوك مؤازر ، والتي تستخدم في جميع خطوات نقل السوائل. بالإضافة إلى ذلك ، تم تجهيز النظام بهزازات مدارية وقارئ صفيحة دقيقة (نموذج ، جهاز جزيئي) يخدمه القابض Span-8 بيكمان كولتر بيوميك NXP برمجيات: لغة البرمجة الصكوك الوطنية لابفيو 9.0 البرنامج النصي لبرنامج HiP-FA متاح على https://github.com/ GeneCenterMunich / HiP-FA