مقايسة قمع الجينات المراسل لدراسة التنظيم الانتقالي للجين المستهدف

الملخص

المصدر: Katz، N.، et al. اختبار لقياس ارتباط البروتين والحمض النووي الريبي في البكتيريا. J. Vis. Exp. (2019)

< p class = "jove_content">يوضح هذا الفيديو فحصا في الجسم الحي في البكتيريا لدراسة تفاعل البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBPs) مع الحمض النووي الريبي. يتم تحويل الخلايا البكتيرية بتركيبتين من البلازميد - بلازميد موقع الارتباط الذي يشفر mRNA يحتوي على جين مراسل فلوري في اتجاه مجرى موقع ربط RBP - بينما يعبر بلازميد RBP عن بروتينات RBP تحت سيطرة المحفز. عند الزيادة بوساطة المحفز في إنتاج RBP ، ترتبط RBPs ب mRNA ، مما يؤدي إلى قمع متعدي للمراسل عن طريق تثبيط ارتباط الريبوسوم.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إعداد النظام

1. تصميم البلازميدات في موقع الربط
   1. صمم كاسيت موقع الربط كما هو موضح في الشكل 1. يحتوي كل جين صغير على الأجزاء التالية (5 إلى 3 بوصات): موقع تقييد النسر ، 40 قاعدة من نهاية 5 'من جين مقاومة الكاناميسين (كان) ، محفز pLac-Ara ، موقع ربط الريبوسوم (RBS) ، AUG لجين mCherry ، فاصل (δ) ، موقع ربط RBP ، 80 قاعدة من نهاية 5 'من جين mCherry ، وموقع تقييد ApaLI.
      ملاحظه: لزيادة معدل نجاح الفحص ، قم بتصميم ثلاثة أشرطة لموقع الربط لكل موقع ربط ، مع فواصل تتكون من قاعدة واحدة واثنتين وثلاث قواعد على الأقل. انظر قسم النتائج التمثيلية للحصول على مزيد من الإرشادات.
2. استنساخ بلازميدات موقع الربط
   1. اطلب أشرطة موقع الربط كجينات صغيرة مزدوجة الشريطة من الحمض النووي (dsDNA). يبلغ طول كل جين صغير ∼500 نقطة أساس ويحتوي على موقع تقييد النسر وموقع تقييد ApaLI في النهايين 5 و 3 ، على التوالي (انظر الخطوة 1.1.1).
      ملاحظه: في هذه التجربة ، تم طلب الجينات الصغيرة التي تحتوي على نصف جين الكاناميسين لتسهيل فحص المستعمرات الإيجابية. ومع ذلك ، فإن تجميع جيبسون مناسب أيضا هنا ، وفي هذه الحالة يمكن طلب موقع الربط على أنه قليجوس DNA مكميلي أقصر أحادي الشريطة.
   2. استيعاب كل من الجينات الصغيرة والمتجه المستهدف باستخدام Eagl-HF و ApaLI بواسطة بروتوكول التقييد ، وتنقية العمود.
   3. اربط الجينات الصغيرة المهضومة بالعمود الفقري لموقع الربط الذي يحتوي على بقية جين mCherry reporter ، المنهي ، وجين مقاومة الكاناميسين.
   4. تحويل محلول الربط إلى خلايا الإشريكية القولونية TOP10.
   5. تحديد المحولات الإيجابية عبر تسلسل Sanger.
      1. صمم برايمر 100 قاعدة في اتجاه المنبع إلى منطقة الاهتمام (انظر الجدول 1 للحصول على تسلسلات التمهيدي).
      2. قم بإعداد بعض المستعمرات البكتيرية.
      3. تحضير 5 ميكرولتر من محلول 5 ملي مولار من التمهيدي و 10 ميكرولتر من الحمض النووي بتركيز 80 نانوغرام / ميكرولتر.
      4. أرسل الحلين إلى منشأة ملائمة لتسلسل Sanger.
   6. قم بتخزين البلازميدات المنقاة عند -20 درجة مئوية ، والسلالات البكتيرية كمخزون من الجلسرين ، وكلاهما بتنسيق 96 بئرا. سيتم بعد ذلك استخدام الحمض النووي للتحويل إلى بكتريا قولونية خلايا TOP10 تحتوي على واحدة من أربعة بلازميدات اندماج-RBP (انظر الخطوة 1.3.5).
3. تصميم وبناء بلازميد RBP
   ملاحظة: يتم سرد تسلسل الأحماض الأمينية والنيوكليوتيدات لبروتينات الغلاف المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 2.
   1. اطلب تسلسل RBP المطلوب الذي يفتقر إلى كودون التوقف باعتباره مصغر dsDNA مطلوب خصيصا يفتقر إلى كودون التوقف مع مواقع التقييد في النهايات (الشكل 1).
   2. استنساخ RBP الذي تم اختباره يفتقر إلى كودون التوقف مباشرة في اتجاه مجرى المحفز المحفز ومنبع بروتين الفلورسنت الذي يفتقر إلى كودون البداية (الشكل 1) ، على غرار الخطوات 1.2.2-1.2.4. تأكد من أن بلازميد RBP يحتوي على جين مقاوم للمضادات الحيوية مختلف عن البلازميد في موقع الارتباط.
   3. حدد المحولات الإيجابية عبر تسلسل Sanger ، على غرار الخطوة 1.2.5 (انظر الجدول 1 للحصول على تسلسلات أولية).
   4. اختر محول إيجابي واحد واجعله مؤهلا كيميائيا. قم بتخزينها على شكل بلازميدات منقاة بالجلسرين عند -20 درجة مئوية ومخزون الجلسرين من السلالات البكتيرية عند -80 درجة مئوية في ألواح 96 بئرا.
   5. قم بتحويل بلازميدات موقع الربط (من الخطوة 1.2.6) المخزنة في ألواح 96 بئرا إلى خلايا بكتيرية مختصة كيميائيا تحتوي بالفعل على بلازميد RBP-mCerulean. لتوفير الوقت ، بدلا من طلاء الخلايا على أطباق بتري ، قم بوضعها باستخدام ماصة ذات 8 قنوات على ألواح من 8 حارات تحتوي على أجار لوريا بيرتاني (LB) مع المضادات الحيوية ذات الصلة (كان وأمبير). يجب أن تظهر المستعمرات في 16 ساعة.
   6. حدد مستعمرة واحدة لكل محول مزدوج وتنمو بين عشية وضحاها في وسط LB مع المضادات الحيوية ذات الصلة (Kan و Amp) وقم بتخزينها كمخزونات من الجلسرين عند -80 درجة مئوية في ألواح 96 بئرا.

2. إعداد التجربة

ملاحظة: تم تنفيذ البروتوكول المقدم هنا باستخدام نظام آلي لمعالجة السوائل بالاشتراك مع حاضنة وقارئ لوحة. تم إجراء كل قياس ل 24 تركيزا محفزا ، مع تكرارين لكل مجموعة سلالة + محفز. باستخدام هذا النظام الآلي ، تم جمع بيانات عن 16 سلالة يوميا مع 24 تركيزا محفزا. ومع ذلك، إذا لم يكن مثل هذا الجهاز متاحا، أو إذا كانت هناك حاجة إلى عدد أقل من التجارب، فيمكن إجراؤها بسهولة يدويا باستخدام ماصة متعددة القنوات ذات 8 قنوات وتكييف البروتوكول وفقا لذلك. على سبيل المثال ، تم الحصول على نتائج أولية لأربع سلالات يوميا مع 12 تركيزا محفزا وأربع نقاط زمنية بهذه الطريقة.

1. قم بإعداد 1 لتر من المخزن المؤقت للمقايسة الحيوية (BA) مسبقا عن طريق خلط 0.5 جم من التربتون ، و 0.3 مل من الجلسرين ، و 5.8 جم من كلوريد الصوديوم ، و 50 مل من 1 م مجم₄ ، و 1 مل من الرقم الهيدروجيني المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) 10x 7.4 ، و 950 مل من الماء المقطر المزدوج (DDW). الأوتوكلاف أو تصفية المعقمة المخزن المؤقت BA.
2. قم بزراعة السلالات ذات المحولات المزدوجة عند 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة مع اهتزاز في 1.5 مل رطل مع المضادات الحيوية المناسبة (الكاناميسين بتركيز نهائي قدره 25 ميكروغرام / مل وأمبيسلين بتركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل) ، في ألواح 48 بئرا ، على مدى 18 ساعة (بين عشية وضحاها).
3. في الصباح ، قم بالاستعدادات التالية.
   1. لوحة المحفز. في صفيحة نظيفة من 96 بئرا ، قم بإعداد الآبار ذات الوسط شبه الفقير (SPM) التي تتكون من 95٪ BA و 5٪ LB26 في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. يتوافق عدد الآبار مع العدد المطلوب من تركيزات المحفز. أضف C4-HSL إلى الآبار الموجودة في لوحة المحفز التي ستحتوي على أعلى تركيز محفز (218 نانومتر).
   2. قم ببرمجة الروبوت لتخفيف الوسط بشكل متسلسل من كل بئر من الآبار ذات التركيز الأعلى إلى 23 تركيزا أقل تتراوح من 0 إلى 218 نانومتر. يجب أن يكون حجم كل تخفيف محفز كافيا لجميع السلالات (بما في ذلك التكرارات).
   3. أثناء تحضير التخفيفات المحفزة ، قم بتسخين 180 ميكرولتر من SPM في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، في ألواح 96 بئرا.
   4. تمييع السلالات الليلية من الخطوة 2.2 بمعامل 100 عن طريق التخفيفات التسلسلية: أولا ، قم بالتخفيف بمعامل 10 عن طريق خلط 100 ميكرولتر من البكتيريا مع 900 ميكرولتر من SPM في ألواح 48 بئرا ، ثم قم بتخفيفها مرة أخرى بمعامل 10 عن طريق أخذ 20 ميكرولتر من المحلول المخفف إلى 180 ميكرولتر من SPM الدافئ مسبقا ، في ألواح 96 بئرا مناسبة لقياسات الفلورسنت.
   5. أضف المحفز المخفف من لوحة المحفز إلى الألواح المكونة من 96 بئرا مع السلالات المخففة وفقا للتركيزات النهائية.
4. رج الألواح المكونة من 96 بئرا عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات ، مع أخذ قياسات الكثافة الضوئية عند 595 نانومتر (OD595) ، و mCherry (560 نانومتر / 612 نانومتر) ، و mCerulean (460 نانومتر / 510 نانومتر) عبر قارئ الألواح كل 30 دقيقة. لأغراض التطبيع ، قم بقياس نمو SMP بدون إضافة خلايا.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: نظرة عامة على خطوات تصميم النظام والاستنساخ. رسم توضيحي لتصميم الكاسيت لموقع الربط البلازميد (يسار) و RBP-mCerulean البلازميد (يمين). الخطوة التالية هي التحويلات المتتالية لكلا البلازميدات إلى بكتريا قولونية خلايا مختصة ، مع بلازميدات RBP أولا. ثم يتم اختبار المحولات المزدوجة لمستويات تعبير mCherry الخاصة بها في زيادة تركيزات المحفز. إذا ارتبط RBP بموقع الربط ، تنخفض مستو...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ملح الصوديوم أمبيسلين سيغما أ 9518 كبريتات المغنيسيوم (MgSO4) ألفا إيسار 33337 48 طبق أكسايجن ب -5 مل - 48 - سي إس لوحات ذات 8 حارات أكسايجن RESMW8I 96 أطباق بئر أكسايجن ب - DW - 20 - ج لوحات 96 بئر لقارئ الألواح بيركين إلمر 6005029 أبالي NEB R0507 تسلسل مواقع الربط شركة Gen9 و Twist Bioscience انظر الجدول 1 بكتريا قولونية TOP10 خلايا إنفيتروجين C404006 إيجل إتش إف NEB R3505 الجلسرين المختبر الحيوي 71205 حاضنه تيكان حاضنة Liconic كاناميسين سولفات سيغما ك 4000 KpnI- HF NEB R0142 ليغاز NEB B0202S نظام آلي لمعالجة السوائل تيكان EVO 100 ، MCA 96 قناة برنامج تحليل MATLAB الرياضيات ماصات متعددة 8 حارات أكسايجن BR703710 N-butanoyl-L-homoserine lactone (C_4-HSL) كايمان K40982552 019 المخزن المؤقت PBS الصناعات البيولوجية 020235 أ قارئ اللوحة تيكان لافينيت F200 PRO Q5 HotStart بوليميراز NEB م 0493 تسلسلات RBP أدجين 27121 & 40650 انظر الجدول 2 كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) المختبر الحيوي 190305 SV جل ونظام تنظيف PCR بروميجا أ 9281 التربتون دينار بحريني 211705