الاختبار الهجين المعدل للخميرة الواحدة للكشف عن تفاعلات الحمض النووي المركب للبروتين غير المتجانس

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Tripathi ، P. et al. ، نظام هجين معدلة من الخميرة لدراسات تفاعل البروتين غير المتجانس المركب والحمض النووي. J. Vis. Exp. (2017)

في هذا الفيديو ، نوضح اختبار الخميرة المعدل أحادي الهجين ، والذي يكتشف بروتينات متعددة تتفاعل مع الحمض النووي المستهدف. تحتوي خلايا الخميرة المحولة على تسلسل الحمض النووي المستهدف في اتجاه المنبع لجين المراسل. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تعبر عن بروتينات عامل النسخ. عندما تشكل البروتينات مجمعات وترتبط بالحمض النووي المستهدف ، يتم التعبير عن جين المراسل ويمكن اكتشافه إنزيميا.

البروتوكول

1. اليوم 9 (صباحي): ابدأ المزرعة للقياس الأنزيمي.

1. أعد تعليق الاستزراع ونقل 125 ميكرولتر باستخدام ماصة متعددة القنوات على لوحة مقياس الطيف الضوئي (قياس OD₆₀₀).
   ملاحظه: تحذير: لا تستغني عن القطرة الأخيرة لتجنب الفقاعات ، إذا كان OD₆₀₀ أقل من 0.3 - 0.6 ، فقم باحتضان الخلايا المتبقية لمدة 1 - 2 ساعة أخرى بناء على القراءة. يمكن التخلص من ثقافة 125 ميكرولتر المستخدمة في هذه الخطوة أو نقلها مرة أخرى إلى كتلة البئر العميقة الأصلية وفقا لتقدير المستخدم.
2. قم بالطرد المركزي للخلايا المتبقية في كتلة البئر العميقة لمدة 10 دقائق عند 3000 × جم و 21 درجة مئوية. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلبها.
3. أضف 200 ميكرولتر من Z-buffer و vortex.
   ملاحظه: يرجى الاطلاع على وصفة Z-buffer في الجدول 1.
4. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 3000 × جم و 21 درجة مئوية. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلبها.
5. أضف 20 ميكرولتر Z-buffer والدوامة.
6. قم بتغطية اللوحة بورق مانع للتسرب يمكنه مقاومة دورات التجميد والذوبان. قم بإجراء 4 دورات من التجميد / الذوبان باستخدام النيتروجين السائل في غطاء الدخان ثم 42 درجة مئوية في حمام مائي (2 دقيقة لكل منهما).
7. أضف 200 ميكرولتر Z-buffer / beta-mercaptoethanol (β-ME) / Ortho-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) (12 مل ، 21 ميكرولتر ، 8.4 مجم على التوالي سينتج 20 مل محلول ؛ تحضير طازج دائما).
   ملاحظه: سيستغرق ONPG بعض الوقت ليذوب بشكل صحيح ، لذا قم بإعداد المحلول قبل ساعة من الوصول إلى هذه الخطوة. يعمل ONPG كركيزة لقياس نشاط β-galactosidase.
8. احتضن لمدة تصل إلى 17 - 24 ساعة عند 30 درجة مئوية (تحقق بينهما ، إذا تطور اللون في وقت مبكر ، فانتقل إلى الخطوة التالية).

2. اليوم 10 (الصباح): أوقف رد الفعل والقياس.

1. أضف 110 ميكرولتر 1M Na₂CO₃ لإيقاف التفاعل وتسجيل الوقت.
2. دوامة وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 3000 × جم و 21 درجة مئوية.
3. خذ 125 ميكرولتر من المادة الطافية باستخدام القنوات المتعددة وقم بقياس OD₄₂₀.
   ملاحظه: الحذر ، لا تستغني عن القطرة الأخيرة لتجنب الفقاعات.

الجدول 1: وصفة الحلول المستخدمة في البروتوكول. يوفر الجدول وصفة للمخزون وحلول العمل للمخازن المؤقتة الرئيسية المستخدمة في المقايس.

عازلة TE 10X (10 مل) مرغوب من المخزون 1000 ملي تريس كلوريد (درجة الحموضة 8.0) 1 مل من تريس 1 م 10 ملي مولار EDTA (درجة الحموضة 8.0) 200 ميكرولتر من EDTA 0.5 متر اصنع الحجم بالماء TE / LiAc (10 مل) مرغوب من المخزون 1 مرة 1 مل TE 10X 0.1 مليون لياك 1 مل LiAc 1 م اصنع الحجم بالماء TE / LiAc / PEG (50 مل) 50٪ مرغوب من المخزون 1 مرة 5 مل TE 10X 0.1 مليون لياك 5 مل LiAc 1 م 40 مل PEG3350 Z-buffer (1 لتر) درجة الحموضة 7.0 Na₂HPO4 16.1 جرام من سباعي الماء أو 8.52 جرام من اللامائي NaH₂PO4 5.5 جم من الماء أو 4 جم من اللامائي KCl 0.75g MgSO₄ 0.246 جرام من الماء أو 0.12 جرام من اللامائي الحفاظ على درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك يتم تعقيم جميع المحاليل قبل الاستخدام. لوحات الوسائط والأجار المستخدمة في البروتوكول (YPDA ، SD-Ura ؛ لوحات أجار SD-Trp-Ura و SD-Trp-Ura) تتبع نفس الوصفة كما في Y1H

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 96 بئر صفيحة مستديرة القاع Greiner bio-one 650101 أدوات بلاستيكية كتلة بئر 96 عميقة الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1896-2000 أدوات بلاستيكية رقائق قابلة للغلق الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 2923-0110 أدوات بلاستيكية أراسيل إكسل ساينتيف ب -100 أدوات بلاستيكية 2-ميركابتو إيثانول فيشر ساينتيك 034461-100 تحليل ONPG سيجما ألدريتش هاتف: 73660 تحليل نا₂ثاني أكسيد الكربون₃ سيجما ألدريتش 223484 تحليل نا₂HPO₄ سيجما ألدريتش S3264 تحليل NaH₂PO₄ سيجما ألدريتش S3139 تحليل كيه سي إل فيشر ساينتيك BP366-500 تحليل MgSO₄ سيجما ألدريتش 83266 تحليل حمض الهيدروكلوريك فيشر ساينتيك SA54-4 تحليل حمام جاف ثيرمو فيشر جهاز دوار ثيرمو فيشر جهاز الطرد المركزي إيبندورف جهاز طرد مركزي 5810R جهاز قارئ اللوحة الجهاز الجزيئي SPECTRAMAX PLUS مقياس الطيف الضوئي المجهري جهاز حاضنه ثيرمو فيشر نموذج رقم 5250- 37 درجة ، 6250-30 درجة جهاز حاضنة شاكر نيو برونزويك جهاز حمام مائي ثيرمو فيشر إيزوتيمب 205 جهاز قاعدة تريس فيشر ساينتيك ص ب 152-1 تحليل